[发明专利]一种循环肿瘤外泌体富集芯片及其应用

说明书

本发明涉及到一种循环肿瘤外泌体检测芯片及其应用。该微流控芯片结合侧向位移原理及静电亲和识别原理，实现了外周血中循环肿瘤外泌体的协同高效率、高纯度捕获检测。在微芯片内，设计了修饰有正电荷的聚合物材料、具有特定几何排列方式的“Y”形微柱阵列。通过调控微柱阵列的距离、密度等参数，可控制外泌体在微通道的流动行为，从而提高循环肿瘤外泌体的捕获效率和纯度。

技术领域

本发明涉及一种循环肿瘤外泌体富集芯片设计、理论模拟及应用，涉及微流控芯片及临床诊断领域。

背景技术

目前，很多疾病的诊断依然面临着严峻的挑战。肿瘤是导致病死的主要原因之一，也是目前研究的热点和难点。随着人们对肿瘤转移机制研究的深入，越来越多人认识到肿瘤的早期诊断、及时治疗以及预后检测，在降低癌症死亡率，减少和控制癌症发病率方面的重要性。

外泌体，是直径30-150nm的双层脂质膜包被的小囊泡，是细胞外环境的重要成分之一。目前普遍认为，外泌体存在于血液、尿液、腹水等人体大多数体液中。外泌体可携带多种生物活性物质，包括蛋白质、脂质、及遗传物质如信使RNA(messenger RNA，mRNA)，微小RNA(microRNA，miRNA)及长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)等。外泌体的稳定性极高，在各种冷冻冷藏和解冻条件下都可保存长达数年，含量也极为丰富，每毫升血浆中就含有10⁸-10¹³个外泌体。这些优点赋予了外泌体成为新型肿瘤标志物的可能性，近年来的一些研究也很好地证明了这点。如2015年《Nature》报道在胰腺癌研究中，可检测到细胞表面糖蛋白(glypican-1，GPC1)特异性地表达于胰腺癌细胞来源的外泌体中。通过检测胰腺癌患者血清中GPC1+外泌体，可以将胰腺癌患者同胰腺炎患者，健康人等分开，且可以用于不同进程癌症的分期，特异度和敏感度都接近100％。动物学发明证明了GPC1+外泌体可以比MRI更早地发现胰腺上皮内瘤变，具有胰腺癌早期诊断的价值。由此可见，外泌体具有成为肿瘤新型生物标志物的潜能。

目前的循环肿瘤外泌体分离技术主要分为两类：基于免疫亲和的方法和超速离心（UC）。基于免疫亲和性的方法利用抗体包被的磁珠捕获体液中含有特定标记物的外泌体。该方法允许分离外泌体的特定亚群，但通常不适于从大量生物样品中分离外泌体。离心方法是一种无标记、高通量的分离方法，根据外泌体的大小差异来分离外泌体。可以使用标准离心（20 000g）分离大细胞或囊泡，而必须使用超速离心（100 000g）从蛋白质污染物中纯化外泌体。这种复杂的程序耗时（约5小时），所需设备昂贵，需要严格训练的技术人员操作，且回收率相对较低（5-25%）。尽管通过增加梯度离心步骤，如OptiPrep™碘克沙醇梯度离心，可以获得更高的外泌体纯度，但样品处理方案的进一步复杂化导致分离时间更长。考虑到现有常规方法的缺点，需要一种无标记、快速、高通量的外泌体分离方法。

微流控芯片具有高通量、高比表面积、体积小和消耗少等特点，因此可以设计成具有低成本、高富集效率、高选择性等优点的循环肿瘤外泌体富集微流控芯片。目前利用微流控芯片进行循环肿瘤外泌体检测的方法主要有两种：1)利用亲和性识别捕获；2)利用物理特性差异，比如利用微孔过滤、体积排阻方式或结合电场、声场等外力辅助的方式，根据囊泡大小对外泌体进行分离。滤膜过滤法虽然已经有产品推出，但分离的时候会产生蛋白质堵塞膜孔，外泌体破裂等一系列问题。其他方法则需要专门的仪器，并且效率低，不适合实际应用。总之，目前肿瘤癌症外泌体的高性能捕获及检测仍然较为困难，且费时费力。因此需要寻求一种有效的肿瘤癌症外泌体富集策略。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种超高捕获效率的循环肿瘤外泌体富集。

本发明的第二目的在于提供一种基于微流控芯片上实现循环肿瘤外泌体捕获的方法。

本发明的目的通过以下的技术方案实现：