[发明专利]一种荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条，其特征在于，包括使用蛋白标记荧光微球的免疫荧光微球，所述的免疫荧光微球中，抗体与荧光微球的质量比例为（1-10）：40，抗体选用新型冠状病毒RBD蛋白和新型冠状病毒蛋白二抗CR2，使用含有荧光微球标记的免疫层析法检测新型冠状病毒。

2.根据权利要求1所述的荧光微球标记的免疫层析法制备的新型冠状病毒检测试纸条，其特征在于，检测试纸条包括样品垫、结合垫、吸收垫、反应膜；所述的样品垫，作为待测样品加入的部位，与结合垫以及反应膜连通；所述的结合垫，与免疫荧光微球结合；所述的反应膜，连接新冠病毒抗原，所述的新冠病毒抗原识别新冠病毒抗体；所述的吸收垫，吸收未与结合垫或者反应膜结合而留存的液体所含物质。

3.一种根据权利要求1或2所述荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备免疫荧光微球：

a. 活化：量取偶联液180 μL于1.5 mL离心管，加入荧光微球200 – 400 μg，加入0.05mL偶联液溶解的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC ) 100 μg和0.05 mL偶联液溶解的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） 100 μg，于37℃反应0.5h，10000 rpm离心后用0.05mL pH 8.0 磷酸盐缓冲盐溶液（PBS缓冲液）重悬，得活化的荧光微球；

b. 偶联：向活化的荧光微球中加入偶联液稀释的新型冠状病毒RBD蛋白 10 μg，新型冠状病毒蛋白二抗CR2 10 μg于37℃反应0.5h后至于4℃过夜；

c. 封闭：取出4℃的步骤b的荧光微球，加入封闭液0.3 mL，加入5% 吐温20（Tween-20）0.1 mL，于37℃反应0.5h；

d. 保存：将荧光微球从37℃取出，离心去除上清，并用保存液清洗两遍后加入50 μL保存液保存；

（2）荧光微球偶联物的固定：

a. 超声：用超声处理高浓度的荧光微球偶联物15 min，使荧光微球分散；

b. 稀释：用荧光微球稀释液将超声处理后的荧光微球偶联物1:（50 -100）稀释到工作浓度，混匀；

c. 涂于玻璃纤维：稀释后的荧光微球偶联物均匀的涂于玻璃纤维上，使纤维均匀的吸水；

d. 干燥：将玻璃纤维放入37℃的烘房中干燥过夜，然后取出避湿保存，得结合垫；

（3）反应膜的制备：

a. 稀释：根据所需要的抗原和抗体浓度，将RBD和HRP稀释到工作浓度，T线： 0.4 mg/mL；C线：1 mg/mL；

b. 贴膜：取底板、硝酸纤维素膜（NC膜）、吸水纸，在底板上先贴上NC膜，然后再贴吸水纸，将贴好的NC膜在划膜间平衡30分钟；

c. 点膜：用点膜机将配制好的抗原和抗体均匀的划在NC膜的T线和C线位置；

d. 干燥：将划好的NC膜转移至37℃的烘房中干燥过夜，得NC膜；

（4）依序将样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫组装在一起后切成4 mm的细条，放入外壳中，即得荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条。

4.根据权利要求3所述荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述的偶联液：50 mM MES溶液，pH 6.0；20 mM PB溶液，pH 8.0。

5.根据权利要求3所述荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述的封闭液：20 mM PB溶液，pH 7.4，2% BSA，0.1% Proclin300。

6.根据权利要求3所述荧光微球标记的免疫层析法新型冠状病毒检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述的保存液：10 mM PBS溶液，pH 7.4，0.5% BSA，0.05% Tween-20，0.5%蔗糖，0.1% Proclin300。