[发明专利]一种环状RNA原位检测方法

说明书

本发明公开了一种环状RNA原位检测方法，通过滚环扩增实现对信号的放大，其前提是将检测目标核酸分子转化为检测与目标核酸分子特异对应的环状核酸分子。该方法通过一条单链DNA构成锁式探针的两段区域与目标核酸的靶序列特异杂交，当探针两端的碱基与靶序列完全互补时，DNA连接酶将探针两端连接形成一个环状DNA分子，而后通过滚环扩增对环状DNA分子进行扩增，最后再用检测探针检测扩增产物实现对目标RNA的检测。本发明能够高灵敏地检测环状RNA在不同组织或者同一组织不同部位的存在和分布状况。

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种环状RNA原位检测方法。

背景技术

环状RNA(circularRNA，circRNA)是在转录过程中，通过可变剪接形成的一类首尾相接的环状RNA分子。与它的线性转录本相比，环状RNA由于没有5’和3’端，因此更加的稳定，不易被RNA酶降解。越来越多的证据表明，环状RNA在许多的重要的疾病和癌症当中发挥着重要的作用。

核酸原位检测技术能够对细胞和组织样本中的DNA和RNA进行定位检测。传统的核酸原位检测技术为原位杂交技术(ISH)，该方法通过标记的检测探针与目标核酸进行杂交，未结合的探针被洗去，与目标核酸特异杂交的检测探针通过标记被检测，从而实现目标核酸的检测。其中，单分子荧光原位杂交技术(smFISH)通过在单个RNA分子上杂交多个检测探针获得足够强的信号而实现对单个RNA分子进行原位检测。与传统的ISH相比，单分子荧光原位杂交技术具有更高的灵敏度和特异性。然而，由于技术本身原理的限制，smFISH技术无法将同一基因的线性RNA转录本和环状RNA区分开来，因而不适用于环状RNA的原位检测。

目前，国内实验室常用的环状RNA检测试剂盒是美国ACD公司的BaseScope的原位杂交试剂盒，它是基于分支DNA技术(Branched DNA technology，bDNA)的原理开发应用的。其中bDNA技术是由一对双Z形探针杂交至靶序列，通过逐级放大信号，最后采用红色显色底物检测。单个RNA转录本显示为红色点状或团簇状信号。

发明内容

本发明的目的在于提供一种环状RNA原位检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种环状RNA原位检测方法，包括如下步骤：

(1)设计至少一锁式探针，该至少一锁式探针与待测样品中的待检测的环状RNA特异的杂交互补；

(2)通过能够以RNA为模板连接DNA的DNA连接酶将与上述环状RNA特异互补杂交的锁式探针沿所述环状RNA补齐核苷酸，获得至少一环形模板；

(3)以上述至少一环形模板为扩增模板，进行滚环扩增，获得至少一滚环扩增产物；

(4)将上述至少一滚环扩增产物与至少一检测探针杂交以进行环状RNA的原位检测。

在本发明的一个优选实施方案中，所述待测样品为培养的细胞、组织中的细胞或组织切片中的细胞。

进一步优选，所述待测样品为组织切片中的细胞。

在本发明的一个优选实施方案中，所述DNA连接酶为SplintR连接酶。

在本发明的一个优选实施方案中，所述滚环扩增所用的酶为phi29聚合酶。

在本发明的一个优选实施方案中，所述检测探针修饰有荧光标记物、显色标记物、酶标记物、放射性标记物、磁性标记物或发光密度标记物。

在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一锁式探针含有自然和/或非自然核苷酸。

在本发明的一个优选实施方案中，所述待测样品为组织切片中的细胞，所述DNA连接酶为SplintR连接酶，所述滚环扩增所用的酶为phi29聚合酶。