[发明专利]一种提高棉花活体基因转化效率的方法

说明书

本发明公开了一种提高棉花活体基因转化效率的方法，在花瓣开放时，将含有目的基因的农杆菌菌液喷施于棉花花朵雄蕊及柱头上，花瓣闭合前在柱头顶端套上内含浸润过农杆菌菌液的脱脂棉球的套管，并在花柄处喷施赤霉素。本发明通过延长柱头的保湿时间，提高了转化效率。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地说是涉及一种提高棉花活体基因转化效率的方法。

背景技术

目前棉花基因转化常用的方法主要是基于组织培养的农杆菌介导法，该方法存在转化周期长、成本高、效率较低等问题，长期以来制约着棉花基因工程研究的发展。因此改进棉花转基因方法，提高功能基因转化的效率是棉花基因工程及遗传育种研究中急需解决的主要问题之一。

模式植物拟南芥的农杆菌“浸花法”具有不受宿主专一性和受体材料基因型的限制、不需要经过漫长的植物组织培养过程、实验周期较短、操作简单等优点，适合大规模的农作物遗传转化。近年来农杆菌介导的棉花活体转化技术已有初步的尝试，但由于棉花的自身性状及大田生长条件的限制，农杆菌活体转化的效率依然很低，需要进一步的优化改良。

因此，如何提供一种提高棉花活体基因转化效率的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种提高棉花活体基因转化效率的方法，通过延长柱头的保湿时间，提高了转化效率。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提高棉花活体基因转化效率的方法，在花瓣开放时，将含有目的基因的农杆菌菌液喷施于棉花花朵雄蕊及柱头上，花瓣闭合前在柱头顶端套上内含浸润过农杆菌菌液的脱脂棉球的套管，并在花柄处喷施赤霉素。

以上技术方案达到的技术效果是：目前已经公开的棉花喷花转化法仅是在棉花开花后进行简单的喷施，夏季炎热高温，菌液在短时间内容易蒸发，柱头浸染时间较短，影响转化效率，所以，在喷施农杆菌菌液后，对农杆菌进行套管处理，管中含有浸润过农杆菌菌液的脱脂棉，这样，可以起到对柱头和雄蕊保湿的作用，防止风干，显著提高了基因的转化效率。

作为本发明优选的技术方案，所述农杆菌菌液的制备过程包括：

1)将目的基因连接到PCAMBIA2301载体的多克隆位点，然后将载体转入农杆菌菌株LBA4404中，存放于-70℃冰箱备用；转化前一周，将含PCAMBIA2301载体质粒的农杆菌添加到含抗生素的YEB细菌培养基上培养2～3d后，挑单菌落接种于含抗生素的YEB液体培养基中，悬浮培养过夜，得储备菌液，4℃冰箱保存备用；

2)在转化前一天，将步骤1)所得储备菌液接种至含抗生素的YEB液体培养基中培养过夜，得菌液；

3)转化当天，将步骤2)所得菌液离心，弃上清，用含蔗糖50g/L和乙酰丁香酮100μmol/L的1/2MS液体培养基悬浮沉淀，调OD₆₀₀值为0.4～0.6，作为农杆菌菌液。

以上技术方案达到的技术效果是：本发明所采用的植物转基因载体为PCAMBIA2301，该载体包含抗卡那霉素的NPTII基因和GUS报告基因，可用于转基因植株方便快捷检测。载体上多克隆位点含有多个酶切位点，可依据需要连接不同的启动子和需要转化的目的基因，加入乙酰丁香酮可以促进农杆菌的浸染，利用基因转化。

作为本发明优选的技术方案，步骤1)中，悬浮培养的条件为28℃，200rpm。

作为本发明优选的技术方案，步骤2)中，储备菌液和YEB液体培养基的体积比为1:10。

作为本发明优选的技术方案，步骤3)中，所述离心为在4000rpm下离心10min。

作为本发明优选的技术方案，喷施农杆菌菌液的时间为棉花盛花期。