[发明专利]一种鸡松果体细胞的分离及原代培养方法

说明书

本发明提供了一种原代鸡松果体细胞分离及原代培养方法，包含以下步骤：取胚胎期鸡松果体组织，清洗后，将松果体组织剪碎，在0.25％胰蛋白酶中消化15分钟，终止消化后收集细胞沉淀，之后加入细胞接种液并过200目网筛，在细胞培养箱中培养6～8h后，取出更换细胞培养液后置于培养箱中继续培养，获得的细胞纯度高，细胞形态好。

技术领域

本发明设计鸡松果体细胞离体培养技术领域，特别设计一种鸡松果体细胞分离及原代培养方法。

背景技术

禽类松果体位于大脑两半球和小脑之间的三角形间隙内，顶部与硬脑膜相连接，尖部向下延续为长的细柄与第三脑室相连。松果体是禽类重要的光内分泌器官，被认为是生物节律研究的模型，其整合光信息通过分泌褪黑激素调控机体。众所周知，褪黑激素可以改善睡眠质量，参与抗氧化系统，防止细胞产生氧化损伤，控制机体内各种内分泌腺的活动，进而控制动物全身的机能。目前禽类松果体功能相关研究较少，松果体细胞体外培养可以去除体液因素以及外来神经对松果体的作用，可作为研究其自身分泌功能、特性以及合成的重要方法。禽类松果体原代细胞分离及培养，建立原代细胞培养方法，为研究禽类松果体的功能积累材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡原代松果体细胞分离与培养的新方法，以弥补鸡原代松果体细胞分离与培养方法的空白，为鸡松果体功能的研究提供工具细胞。

为达到上述目的，本发明提供了一种鸡原代松果体细胞分离与培养的新方法，具体内容如下：

一方面，本发明提供了一种鸡原代松果体细胞分离方法，包括以下步骤：

无菌条件下取出鸡胚松果体组织，放入提前预冷含有1％三抗的PBS中；

用含有1％三抗的PBS清洗组织3次，利用显微手术镊去除周围的血管和外膜。

将组织转移至1.5ml离心管底部，加入少量1％三抗的PBS，以覆盖组织为宜。

将组织剪碎后，静置5分钟后，组织块沉降之后，弃去上层PBS。组织块转移至15ml离心管，加入0.25％胰蛋白酶，37℃水浴消化15分钟。

加入提前预热的完全培养基终止消化，1000r/min，离心5分钟收集细胞沉淀。

加入5ml细胞接种液重悬细胞沉淀，经200目细胞网筛过滤未消化好的大组织块，收集细胞悬液；

采用血球计数板细胞计数，添加细胞接种液，调整细胞浓度为1×10⁶/mL；

细胞轻轻吹打混匀后，接种至6孔板中，置于39℃，5％CO₂培养箱中培养6～8h，更换为细胞培养液，继续放入培养箱中培养。培养两天后松果体细胞状态具有神经样细胞形态，可用于细胞试验。

在以上技术方案的基础上，优选的完全培养基为89％DMEM培养基，10％胎牛血清(FBS)和1％三抗；

在以上技术方案的基础上，优选的细胞接种液为78％DMEM，20％FBS，1％三抗，1％L-谷氨酰胺；

在以上技术方案的基础上，优选的细胞培养液为95.999％Neurolbasal培养基，2％的B27、1％三抗，1％L-谷氨酰胺，0.001％阿糖胞苷；

在以上技术方案的基础上，优选的细胞培养箱的温度为39℃。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明弥补了原代鸡松果体细胞分离和培养方法的空白。

本发明采用胚胎期松果体进行原代松果体细胞分离培养具有一定的优势：①试验材料成本低，容易获得；②胚胎期鸡胚的头盖骨没有钙化，质地较软，便于在较短时间内完成采样；③胚胎期松果体较成年动物的增殖能力强。