[发明专利]一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用

说明书

本发明公开了一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用，属于医药技术领域。本发明以大肠杆菌表达的黄热病毒E蛋白作为抗原，通过流式分选，从一例康复期患者的PBMCs中筛选到可以特异结合黄热病毒E蛋白的记忆B细胞，然后对筛选的单一B细胞进行RT‑PCR及PCR扩增，获得抗体的可变区片段，并进一步与恒定区连接至表达载体中。本发明获得的6株人源抗体均有很强的YFV中和活性，IC50值达0.03～3.5ug/mL，可以完全或部分保护小鼠免受致死剂量的YFVChina的攻击。本发明的6株人源抗体有着临床治疗或预防YFV感染的应用价值。

本申请是原申请号为CN201810302091.2，原申请日为2018年04月04日，发明名称为一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种高灵敏度的黄热病毒人源单克隆抗体及其应用，属于医药技术领域。

背景技术

黄热病毒（yellow fever virus，YFV），单股正链RNA病毒，属于黄病毒科黄病毒属，是一种蚊媒传播的可引起人类致病的病原体，同一科病毒还包括寨卡病毒（zikavirus，ZIKV）、登革病毒（dengue virus，DENV）、西尼罗病毒（west nile virus，WNV）等。YFV是引起黄热病的重要病原，严重时会引起出血热伴随多器官衰竭，尤其是肝、脾、淋巴结、心、肾。

在1996年时，科学家曾估计每年在非洲和南美洲黄热病毒可引起20万人感染，30万人死亡。近两年，巴西、安哥拉和刚果民主共和国等地发生了黄热病暴发，已造成数百人死亡，死亡率达14%，中国在2016年有11例输入病例。目前，临床上已有减毒疫苗（YFV 17D），但疫苗短缺和接种率不足导致疾病频繁爆发，非免疫个体仍处于危险之中。在YFV感染后，临床上没有可用于治疗该疾病的有效的特异性药物。

迄今为止，中和抗体已被证明是治疗病毒性疾病的有效方法，包括人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒和其它黄病毒等。黄病毒表面的E蛋白（Envelope）识别细胞表面的受体，进而促进病毒膜与细胞膜发生膜融合，由三个不同的结构域（DI，DII和DIII）完成这些过程。因此，E蛋白是机体免疫系统产生的中和抗体作用的重要表位。

已有研究发现有一些人源抗体具有中和活性，可以中和2001年之前的部分黄热病毒毒株，如：5A、7A、R3(27)等可以中和 Central African Republic (CAR) 1986、Ethiopia1961、Senegal1990、Nigeria1987、 Ghana 1927 (Asibi)和疫苗株YFV 17D。然而，RNA 病毒在抗体压力下，具有高突变的特性，尽管已经有些中和抗体被鉴定，但是更多的针对不同表位的新的抗体对于治疗是必不可少的。本发明的目的是鉴定特异的具有保护作用的新的YFV中和抗体。

发明内容

为了解决上述问题，本发明首先以大肠杆菌表达的YFV-E蛋白作为抗原，通过流式分选，从一例康复期YFV患者的PBMCs中筛选到可以特异结合YFV-E蛋白的记忆B细胞，然后对筛选的单一B细胞进行RT-PCR和PCR扩增，获得6株抗体的可变区片段，并进一步与恒定区连接至表达载体中。测序正确后，经哺乳动物细胞表达、纯化，进行一系列的功能检测，包括与YFV-E蛋白的结合力，体外中和效果，体内保护能力等检测。

本发明的第一个目的是提供一种抗体，如（1）~（6）任一所示：

（1）抗体命名为YD2，其重链可变区含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，轻链可变区含有 SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

（2）抗体命名为YD25，其重链可变区含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，轻链可变区含有 SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

（3）抗体命名为YD62，其重链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，轻链可变区含有 SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；