[发明专利]一种目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法有效
| 申请号： | 202110864810.1 | 申请日： | 2021-07-29 |
| 公开（公告）号： | CN113564206B | 公开（公告）日： | 2023-09-26 |
| 发明（设计）人： | 沈煜;郑会会 | 申请（专利权）人： | 山东大学 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12R1/865 |
| 代理公司： | 济南圣达知识产权代理有限公司 37221 | 代理人： | 李健康 |
| 地址： | 266237 *** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 目的 基因 拷贝 整合 酿酒 酵母 染色体 rdna 方法 | ||
1.一种目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法，是将待转化的酿酒酵母先在含有羟基脲的培养基上进行预培养，然后再通过常规转化方法将两端带有rDNA同源序列的DNA片段转入酿酒酵母，最后在筛选培养基上筛选转化子实现；其特征在于：所述含有羟基脲的培养基是指在酵母常规培养基的基础上，添加终浓度为150mM的羟基脲；所述在含有羟基脲的培养基上预培养的方法是：将待转化的酿酒酵母活化后，转接到含羟基脲的培养基中培养，按每两天转接一次，每次都是转接到新鲜的含有羟基脲的培养基中，总共培养6-8天；所述两端带有rDNA同源序列的DNA片段含有筛选标记基因表达盒和目的基因表达盒，其组成及顺序为3’-rDNA同源序列1-筛选标记基因表达框-目的基因表达框-rDNA同源序列2-5’；其中rDNA同源序列1或rDNA同源序列2是5S rDNA或35S rDNA区域的同源序列，筛选标记基因表达框或目的基因表达框上下游顺序随意，目的基因表达框可以是一个或多个；其中筛选标记基因是抗生素抗性基因G418；所述筛选培养基针对的是引入转化子并表达的筛选标记基因，是带有20000mg/L G418，同时含有60mM羟基脲的YEPD培养基。
2.根据权利要求1所述目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法，其特征在于：所述rDNA同源序列1或rDNA同源序列2是35S rDNA区域的同源序列。
3.根据权利要求1所述目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法，其特征在于：所述两端带有rDNA同源序列的DNA片段是rDNAup-GFP-KanMX-Ru-xylA-rDNAdown，其是利用SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物rDNA-1-F和SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的引物rDNA-2-R，以SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的质粒pEASY-Blunt-GFP-kanMX-RuXI扩增获得。
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