[发明专利]一种诱导培养基及诱导获得癌细胞持续感染NDV的方法

说明书

本发明涉及一种诱导培养基及诱导获得癌细胞持续感染NDV的方法，诱导培养基是由以下成分组成：DMEM高糖培养基、胎牛血清、β‑巯基乙醇、维生素A、N2细胞培养添加剂、B27细胞培养添加剂。本发明可以显著提高癌细胞的诱导效率，对食管癌细胞EC9706诱导效率提升99.9倍，对胃癌细胞系BGC823诱导效率提升260.75倍。

技术领域

本发明涉及一种诱导培养基及诱导获得癌细胞持续感染NDV的方法，属于生物技术领域。

背景技术

溶瘤病毒疗法是治疗癌症的一种方法，溶瘤病毒能够选择性杀伤肿瘤细胞，并且对人正常组织无明显毒性，理论上是治疗癌症的一个较完美材料。但是，溶瘤病毒种类较多，其中部分已经有很长的发现历史，但病毒溶瘤至今未成为治疗癌症的主流方法，表明其中仍有很多需要解决的问题。一个很重要的原因，目前对癌细胞抵抗溶瘤病毒杀伤机制缺乏了解。

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是一种溶瘤病毒。正常人体内不存在抗NDV抗体，易于感染成功；NDV能选择性杀伤肿瘤细胞，有对人体正常组织损伤较轻或不明显等优点。但是，在使用NDV溶瘤时，存在多次使用后溶瘤效果减弱的现象，并且至今没有研究报道揭示这种现象出现的机制，造成NDV溶瘤没有在临床上被广泛尝试应用。

对NDV敏感的细胞可能本身不具备抵抗病毒杀伤的机制，而对NDV不敏感的癌细胞虽然具备抗病毒机制，但是往往分化程度比较高，很难找到合适的参照细胞来筛选出是细胞内哪些因素导致其抵抗病毒杀伤。因此，缺乏合适的细胞模型，造成研究癌细胞抵抗溶瘤病毒杀伤机制存在困难。

现在有一项技术，可以通过诱导细胞产生抗NDV病毒的能力，这样就可以研究细胞发生哪些变化影响细胞获得抗病毒杀伤的能力。目前已经在BHK-21细胞上诱导获得持续感染NDV的BHK-21细胞，但是在其它的细胞还没有报道，一个最重要的原因是诱导效率极低，以易于诱导成功的BHK-21细胞为例，平均一百万个细胞才有一个细胞在NDV感染后进入持续感染状态。对于常见的癌细胞，我们尝试诱导后发现其诱导效率更低，甚至不能成功诱导。基于这样一个问题，我们尝试提高诱导效率，最终配制了一种诱导培养基，该诱导培养基能够将癌细胞的诱导效率提升大约一百倍，并且让一些未曾报道过的癌细胞获得持续感染能力。

发明内容

本发明提供了一种诱导培养基，具体方案为：

一种诱导培养基，是由以下成分组成：DMEM高糖培养基、胎牛血清、β-巯基乙醇、维生素A、N2细胞培养添加剂、B27细胞培养添加剂。

进一步的，通过改变本发明的诱导培养基中胎牛血清含量，将添加胎牛血清体积比设置为2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％。检验出胎牛血清比例为12.5％和15％时诱导效率最高。考虑成本，优选诱导培养基中胎牛血清的体积比浓度为12.5％。

进一步的，在诱导培养基中添加β-巯基乙醇，和未添加β-巯基乙醇的诱导培养基对比，检测对癌细胞诱导效率的影响，发现在添加β-巯基乙醇后，和对照组无明显效率的提升，但是，在不同批次诱导中，诱导成功细胞出现的稳定性增加。进一步通过优选实验确定诱导培养基中β-巯基乙醇添加量为1mmol/L。

进一步的，添加维生素A利于诱导的提高，通过优选实验确定诱导培养基中维生素A添加量为1μmol/L。

进一步的，N2细胞培养添加剂和B27细胞培养添加剂均能够促进诱导效率提升，通过优选实验确定诱导培养基中N2细胞培养添加剂和B27细胞培养添加剂的添加量为1％。

本发明中诱导培养基的培养方法，包括以下步骤：

71取DMEM高糖培养基800ml，向其中加入胎牛血清125ml、β-巯基乙醇约7μL、维生素A 2.865mg、N2细胞培养添加剂10ml、B27细胞培养添加剂10ml,然后定容至1L，得到混合液；