[发明专利]获取目标RNA结合蛋白靶RNA的方法

说明书

本发明涉及一种获取目标RNA结合蛋白靶RNA的方法。所述方法包括a)将透化细胞与特异性识别所述目标RNA结合蛋白(RBP)的抗体以及融合蛋白接触，以在所述透化细胞内形成融合蛋白‑抗体‑RBP‑RNA复合物；所述融合蛋白具有proteinA和/或proteinG结构域、微球菌核酸酶结构域以及配偶体结构域；b)激活所述微球菌核酸酶结构域进行酶切；c)将酶切产物与固相载体共孵育，所述固相载体能够特异性结合所述配偶体结构域以捕获所述复合物；d)洗去未结合的杂质，提取所述复合物中的RNA。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种获取目标RNA结合蛋白靶RNA的方法。

背景技术

RNA结合蛋白(RBP)参与RNA的生成、剪切、降解及功能的发挥。因此RBP-RNA相互作用的检测对于RBP功能的阐释以及RNA功能的理解都至关重要，这也是RNA生物学非常重要的一部分。

目前，关于检测RNA结合蛋白与RNA相互作用的方法大多基于紫外交联免疫沉淀结合高通量测序(crosslinking-immunprecipitation and high-throughput sequencing，CLIP-seq)及其衍生方法。CLIP-seq是目前应用最广泛检测RBP-RNA相互作用的高通量测序分析技术，已被用来多物种细胞系全细胞水平目标RBP与RNAs的相互作用。CLIP-seq及CLIP-seq的衍生方法，其流程大致包括：(1)使用紫外线(UV)或者化学试剂交联细胞；(2)提取可溶性全细胞蛋白裂解液及RNA片段化；(3)用抗体免疫沉淀并富集含目的RBP的核酸片段；(4)RNAadaptor连接；(5)电泳、转膜及RNA提取；(6)反转录及文库构建。

对于CLIP-seq及其衍生方法，主要缺陷包括：1、所用细胞量多；2、不是原位检测；3、交联效率低；4、步骤繁琐、流程所需时间长、易失败；5、效率低，测序量大。

值得注意是的，近几年来针对蛋白质-DNA互作产生了一项新兴技术CUTRUN，全称为cleavage under targets and release using nuclease，由美国Fred Hutchinson癌症研究中心的Steven Henikoff团队开发。从2017年问世至今，目前已有多篇高影响因子的文章发表。这项技术的主要特点是，它可以在完整的细胞或细胞核上进行，无需甲醛固定或超声处理。细胞经过透化处理(扩孔)后与目标抗体孵育，抗体进入核内与目标蛋白结合；细胞再与蛋白A/G连接的MNase孵育，目标抗体Fc段结合Protein A-MNase或Protein A/G-MNase。然后激活MNase酶切割结合位点两边的染色质，这些经过切割的片段扩散到细胞核外，而未切割的部分留在核内，可大大降低背景。之后从上清液中收集DNA片段并测序。

CUTRUN方法所需的样本更少，适合研究稀有的细胞群体，但其并没有在RBP-RNA互作领域进行应用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一方面涉及一种获取目标RNA结合蛋白靶RNA的方法，包括：

a)将透化细胞与特异性识别所述目标RNA结合蛋白(RBP)的抗体以及融合蛋白接触，以在所述透化细胞内形成融合蛋白-抗体-RBP-RNA复合物；

所述融合蛋白具有proteinA和/或proteinG结构域、微球菌核酸酶结构域以及配偶体结构域；

b)激活所述微球菌核酸酶结构域进行酶切；

c)将酶切产物与固相载体共孵育，所述固相载体能够特异性结合所述配偶体结构域以捕获所述复合物；

d)洗去未结合的杂质，提取所述复合物中的RNA。

可选地，如上所述的方法，所述透化细胞固定于固相支持物上。

可选地，如上所述的方法，所述固相支持物为微球。