[发明专利]一种水稻抗虫microRNA及其应用

说明书

本发明公开了一种水稻抗虫microRNA及其应用。osa‑miR162a‑m1的核苷酸序列为：tcaataaactgctgcacccag。本发明旨在通过人工优化osa‑miR162a降低对水稻内源基因的沉默同时维持对NlTOR基因表达的有效抑制。通过本发明的优化，水稻内源基因不再被优化后的osa‑miR162a‑m1所抑制，恢复了osa‑miR162a对水稻生长发育的影响，同时依然能够有效地降低褐飞虱产卵量和孵化率。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水稻抗虫microRNA及其应用。

背景技术：

褐飞虱是危害水稻生产的最主要的害虫之一，它通过其口器刺吸水稻茎基部的叶鞘或者叶片，直接取食水稻汁液并且还能够传播细菌、真菌及病毒等给水稻造成二次伤害。已有的防治褐飞虱危害的方法主要是通过喷施化学农药。这种方法虽然高效快速，但大规模地喷施农药容易造成环境污染，且会无差别地杀灭其他益虫，破坏生态。因此开发新型的低毒高效无残留且能够特异性防治褐飞虱的方法具有重要的生产实践意义。

近年来越来越多的研究开始关注利用植物内源microRNA跨物种沉默害虫的基因，从而影响害虫的生长发育，达到控制虫害的目的。MicroRNA(以下简称miRNA)是一类广泛存在于动植物中的单链非编码RNA，其长度通常为20-24bp。植物基因组中编码miRNA前体的基因转录后形成Primary RNA(以下简称Pri-miRNA)，经由RNA酶DCL1加工成具有茎环结构的Pre-miRNA(Precursor miRNA)。而后者被运输到细胞质中经过Dicer酶的降解，将茎环结果去除，形成miRNA/miRNA*双链结构。随后miRNA/miRNA*双链解旋，其中一条miRNA与Argonaute(AGO)蛋白组成沉默复合体蛋白，特异性地结合到与miRNA序列互补配对(或部分互补配对)的靶标mRNA，进而将靶标mRNA降解或者抑制其翻译，达到沉默靶标基因的目的。

植物miRNA能够通过囊泡系统分泌到细胞外，分布在植物外表皮中，后经由动物取食后进入动物体内。植物miRNA具有以下两个重要结构特点使得其具有较高的稳定性：首先植物miRNA能够在HEN1甲基转移酶的催化下，将位于3’末端位置上的核糖的2’-OH基甲基化，甲基化可以保护miRNA不被核酸外切酶降解；其次，植物miRNA能够被植物囊泡包裹降低了其被RNase A等核酸酶降解的风险。植物miRNA较高的稳定性为其跨物种沉默提供了充分的保障。

目前已有大量的研究表明植物miRNA不仅能够调控自身内源基因的表达，同时也能够跨界调控与其互作的其他动植物、微生物基因的表达。例如，喂食水稻的大鼠体内血清能够检测到水稻的osa-miR168a(osa为水稻Oryza Staiva L.简称，下同)，并且能够抑制低密度脂蛋白受体适配蛋白LDLRAP1编码基因的表达。金银花中miR2911在金银花熬汤液中依然能够保持这较高的稳定性。实验表明饲喂小鼠金银花RNA提取物或者金银花熬汤液均能够有效地沉默小鼠体内流感病毒H1N1中PB2和NS1的表达，从而缓解小鼠感染流感后体重下降的病症。棉花还能够通过分泌miR166和miR159等miRNA跨界沉默大丽轮枝菌的Clp-1蛋白酶和Hic-15羟化酶等mRNA的表达，从而抑制该种真菌在棉花叶片上的生长。以上的研究表明植物体内存在天然的miRNA跨物种沉默调控的机制。

而近年来利用这种跨界调控机制，越来越多的研究者尝试通过在植物体内过量表达人工优化后的amiRNA(artificial miRNA)来实现对作物病虫害的控制。例如，Agrawal等人设计了特异性靶向棉铃虫几丁质酶基因的amiRNA。将过量表达该种amiRNA的烟草叶片饲喂棉铃虫，会导致其幼虫停止生长发育，直至死亡。Tian等人通过设计特异性靶向大豆囊肿线虫J15,J20及J23等基因的amiRNA，获得了具有线虫高抗特性的转基因大豆。通过设计特异性靶向害虫、病菌基因的植物amiRNA有望成为未来防控病虫害的新型手段。