[发明专利]一种重组CHO细胞发酵培养生产重组EGFR抗体活性分子的方法

说明书

本发明提供了一种重组CHO细胞发酵培养生产重组EGFR抗体活性分子的方法。所述方法包括下述步骤：(1)接种培养：将用于生产重组EGFR抗体活性分子的CHO细胞株种子液接种于第一培养基中，得初始发酵液，并发酵培养；(2)补料发酵：接种培养发酵48‑96h后，每天或每隔1天或每隔2天补加1‑8％初始培养体积的第二培养基，继续发酵。本发明的方法获得的发酵液副产物少，产量高，非常适合工业化生产。

技术领域

本发明涉及生物医药发酵技术领域，具体而言，涉及一种重组CHO细胞发酵培养生产重组EGFR抗体活性分子的方法。

背景技术

表皮生长因子受体，即EGFR(epidermal growth factor receptor，简称为EGFR)是原癌基因c-erbB1的表达产物，是一个170kDa的跨膜糖蛋白受体酪氨酸激酶，在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生。EGFR的单克隆抗体西妥昔单抗和帕尼单抗的问世大大拓宽了转移性结直肠肿瘤疗效。

糖基化作为抗体最重要的翻译后修饰对抗体的生物活性具有重要的作用，不同糖基化修饰对单抗药物的药化药代特性及药效的发挥有着重要的作用，因此糖基化水平和糖基化修饰类型是单抗药物的重要参数。而中国专利CN 105779394B以葡萄糖和谷氨酸单钠盐为控制参数进行流加培养降低抗体酸性峰含量和改良抗体糖型的细胞培养方法，缺乏对甘露糖修饰的研究。由于甘露糖修饰的单抗分子与C1q的亲和力较低，其CDC活性也较低。甘露糖型对单抗的药代动力学性质影响较大，大量文献报道甘露糖IgG分子在人血循环中具有较短的半衰期。甘露糖结构在人体中容易引起免疫反应。细胞株和生产工艺的变化常也伴随着甘露糖含量的变化。鉴于甘露糖型对单抗产品的活性、药代动力学性质、免疫原性都具有重要影响，甘露糖的糖型和含量被视为单抗产品的关键质量属性(CQA)之一，对甘露糖的控制显得尤为重要。现有的改变糖基化的方法主要是通过基因水平来改造宿主细胞相关的糖基化酶进而改变抗体的糖型或糖基化水平，但该方法周期长，并且由于其安全性、复杂性和稳定性需要较长时间的验证和确定，不利于生物制品的审批。

使用商业化培养基的实践操作中所生产的EGFR抗体与市售西妥昔单抗唾液酸修饰方面，N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)和N-乙酰神经氨酸(NANA)均有，而NAGA易导致免疫反应，临床上出现多例毒副作用的报导。

由于单抗类制品在翻译后修饰过程中产生的电荷异质性对单抗生物学功能的发挥及其重要，因而其成为单抗生产工艺中需要控制的非常重要的质量属性，也是生产工艺稳定性的重要反应指标。电荷异质性产生酸碱峰，而重组EGFR抗体酸性峰的生物学活性只有主峰和碱性峰生物学活性的30-40％，但是酸性峰、主峰和碱性峰具有相似的化学性质，通过后期纯化分离控制电荷异质性具有一定的挑战性，而通过控制细胞培养工艺流程来控制抗体电荷异质性的方法也具有一定的难度，现有的技术表明，现有细胞培养工艺，如专利申请申请号201610153532.8，通过葡萄糖和谷氨酸单钠盐为控制参数进行流加培养，增大谷氨酰胺浓度可以降低酸性峰，使得酸性峰含量由40.35％逐渐降低到37.5％。虽然酸性组分得到了降低，但是占比依然高达37.5％。再加上作为生物制品必须批次间保持一致，使其成为本领域一直难于解决的问题。