[发明专利]一种截短版肺炎球菌表面蛋白A的发酵工艺及纯化方法

权利要求书

1.一种PspA₄^(αHD+PRD)蛋白的纯化方法，其特征在于，其包括以下步骤：

(I)精纯化：将所述含PspA₄^(αHD+PRD)蛋白的粗产物经弱阴离子交换层析、疏水层析和阳离子交换层析后，获得精纯化的PspA₄^(αHD+PRD)蛋白；所述PspA₄^(αHD+PRD)蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2所示；

所述弱阴离子交换层析使用DEAE Sepharose FF，所述疏水层析使用PhenylBestarose HP，所述阳离子交换层析使用SP Sepharose FF；

优选地，所述PspA₄^(αHD+PRD)蛋白来自菌株表达PspA₄^(αHD+PRD)可溶蛋白后收集的菌体；所述纯化方法还包括(II)粗处理：使用精氨酸处理所述的菌体，获得粗产物；其中，所述精氨酸的终浓度为0.5～0.75M，所述菌体的终浓度为0.2～0.5g/mL，例如0.3g/mL。

2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(II)中，所述精氨酸处理后还包括低渗处理，以获得所述粗产物；优选地，步骤(II)包括以下步骤：

(a)将含所述菌体的发酵液进行超滤浓缩，收集菌体浓缩液；

(b)在所述菌体浓缩液中加入精氨酸，室温搅拌例如3h，形成高渗处理液；

(c)将所述高渗处理液按照1:10体积比例与低渗液混合，室温静置例如静置过夜或静置12小时以上，获得混合液；所述低渗液为50mmol/L Tris-HCl、pH8.0、含1mmol/L EDTA；

(d)将所述混合液进行过滤，收集澄清流穿液；

(e)将所述澄清流穿液进行浓缩，收集浓缩截留液；

(f)将所述浓缩截留液使用置换液1进行置换，置换2-5次，获得浓缩置换液；所述置换液1为20mmol/L PB、pH6.5、含1mmol/L EDTA和0.2mol/L NaCl。

3.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤(a)中所述菌体浓缩液中菌体浓度为0.3g菌体/mL；和/或，步骤(c)中所述高渗处理液中精氨酸的终浓度为0.5mol/L；和/或，步骤(d)中所述过滤使用孔径为0.22～0.45μm的膜包；和/或，步骤(a)中所述超滤浓缩、步骤(e)中浓缩使用型号10Kda～30Kda的膜包；和/或，步骤(f)中所述置换进行4次。

4.如权利要求2或3所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)包括：

(1)将(f)中获得的所述浓缩置换液上样于经平衡后的阴离子交换层析柱，冲洗流穿后进行洗脱，收集洗脱液1，所述平衡、冲洗流穿和洗脱使用PB；

(2)将所述洗脱液1调节电导后上样于经平衡后的疏水层析柱，冲洗流穿后进行洗脱，收集洗脱液2，所述平衡、冲洗流穿和洗脱使用PB；

优选地，步骤(1)中所述平衡和冲洗流穿均使用20mmol/L PB、pH6.5、含1mmol/L EDTA和0.2mol/L NaCl的制剂1，所述洗脱使用20mmol/L PB、pH6.5、含1mmol/L EDTA和0.28mol/L NaCl洗脱缓冲液1；

步骤(2)中所述调节电导后的电导为180ms/cm，所述平衡和所述冲洗流穿均使用20mmol/L PB、pH7.5、含1mmol/L EDTA和1.4mol/L(NH₄)₂SO₄的制剂2，所述洗脱使用20mmol/L PB、pH7.5、含1mmol/L EDTA和0.5mol/L(NH₄)₂SO₄的洗脱缓冲液2。

5.如权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述平衡和所述冲洗流穿使用3倍柱体积的制剂1；和/或，所述洗脱使用3倍柱体积的洗脱缓冲液1；

步骤(2)中所述平衡和所述冲洗流穿使用3倍柱体积的制剂2，和/或，所述洗脱使用3倍柱体积的洗脱缓冲液2。