[发明专利]实时荧光定量PCR检测试剂盒、判断槟榔幼苗缺锌状态的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一种实时荧光定量PCR检测试剂盒、判断槟榔幼苗缺锌状态的方法，实验基地进行槟榔缺锌的处理；进行样品的采集；进行ZIP家族分析和引物设计；进行引物的特异性验证；进行实时荧光定量PCR检测。本发明的基于ZIP家族的实时荧光定量的槟榔缺锌的诊断试剂盒，只需提供样品按照所提供的方法进行检测，即可确定槟榔幼苗缺铁和缺锌状态的原因，为后续预防提供依据。本发明通过结构域的差异获得ZIP家族基因，并通过实时荧光定量PCR验证，获得可以判断槟榔缺锌的状态的AcZIP基因；通过引物凝胶成像以及熔解曲线说明了引物的特异性，实时荧光定量PCR结果的相互印证说明了结果的可靠性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种实时荧光定量PCR检测试剂盒、判断槟榔幼苗缺锌状态的方法，尤其涉及一种通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺锌状态的方法。

背景技术

目前，锌(Zn)是植物生长所必需的微量元素，对植物的生长和代谢具有不可替代的作用。锌离子主要作为蛋白质的复合物和多种蛋白质的激活剂存在，参与多种生命活动，包括碳水化合物代谢、蛋白质合成、细胞膜完整性的维持、生长素合成的调节和花粉的形成。植物还需要调控和维持耐环境胁迫所需的基因表达，如高光强和高温。如果过量使用，可能会有潜在的毒性。过量的Zn则因其不受调节的高亲和力而与生物分子中的硫、氮和含氧官能团结合。

荧光定量PCR是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新的核酸定量实验技术，它的原理是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，通过对产物量的实时分析，最终能够对模板的初始浓度，核酸种类、基因突变类型等信息作出准确的判定。目前，荧光定量PCR在生物学研究及个体化医学基因检测领域有着广泛的应用。

ZIP是一个在植物锌的转运中起重要作用的基因，响应植物缺锌，在水稻、玉米、小麦等植物中都得到验证。ZIP基因家族在缺锌的情况下可能会出现差异表达的现象，但现有技术中关于通过ZIP基因家族差异性表达来判断槟榔幼苗缺锌状态的方法尚未见报道。因此，亟需一种可以通过差异基因的表达来判断槟榔幼苗是否处于缺锌状态的方法。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中没有详细的通过分子水平来检测槟榔缺锌的状态，多以生理生化指标来检测槟榔是否处于缺锌的状态，并且关于通过AcZIP基因家族差异性表达来判断槟榔幼苗缺锌状态的方法尚未见报道。

解决以上问题及缺陷的难度为：需要通过多个方面来验证槟榔ZIP基因会响应槟榔的缺锌，之后通过响应的程度挑选变化程度相对显著的基因，并且可以与槟榔其他金属离子的变化趋势不一致，来区分特异响应槟榔缺锌的ZIP基因。

解决以上问题及缺陷的意义为：通过分子水平上ZIP基因的响应情况，反应了槟榔的缺锌的状态，更为准确的说明了槟榔在缺锌情况下的分子响应。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种通实时荧光定量PCR检测试剂盒、判断槟榔幼苗缺锌状态的方法，尤其涉及一种通过荧光定量PCR技术，利用在缺锌中差异表达的基因，来检测槟榔差异基因表达水平的试剂盒及应用。

本发明是这样实现的，一种通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺锌状态的方法，所述通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺锌状态的方法包括以下步骤：

步骤一，实验基地进行槟榔缺锌的处理；

步骤二，进行样品的采集；

步骤三，进行ZIP家族分析；

步骤四，进行引物设计；

步骤五，进行引物的特异性验证；

步骤六，进行实时荧光定量PCR检测。

进一步，步骤一中，所述实验基地进行槟榔缺锌的处理，包括：