[发明专利]一种基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法

说明书

本发明涉及一种基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法，包括以下步骤：外源基因设计、酶切、连接反应、转化获得阳性菌种；质粒的大量培养及纯化，对质粒进行浓缩后，将浓度分别调整为500ng/μL、1000ng/μL、2000ng/μL后于‑80℃保存，获得mstn自体核酸疫苗。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法。

背景技术

肌肉生长抑制素基因(myostatins,mstn)是一种抑制肌肉细胞增殖生长的负调控基因，属于TGF-β家族成员，故又称为gdf-8。研究表明，该基因表达的抑制或突变失活，能阻断Mstn对肌细胞增殖生长的抑制作用，引起广泛的肌肉增殖并显著降低体表脂肪的沉积，产生以肌纤维数量显著增加、体重显著增大为特征的肌肥大现象，即所谓的“双肌性状”。

制备mstn基因工程疫苗并用该疫苗进行免疫，然后利用自身的免疫系统长期生产抗Mstn的抗体，该抗体完全具有专门结合和抑制Mstn的能力，从而能够解除Mstn对肌细胞生长的抑制作用。目前，关于利用mstn进行主动免疫的方法主要集中在畜牧业，如牛、羊、猪等，在水产领域中，尤其是斜带石斑鱼的养殖中很少有关于mstn的报道。

发明内容

本发明克服了现有技术的不足，提供一种基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法。

为达到上述目的，本发明采用的一种技术方案为：一种基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1外源基因设计：外源基因为“KOZAK序列-乙型脑炎病毒信号肽-乙型肝炎病毒表面核心抗原-SS-SS-Th表位-Linker连接序列-斜带石斑鱼mstn成熟肽基因序列”，将其合成并克隆至T载；

S2酶切：采用TAKARA Nhe I和Xho I酶在37℃分别对S1中的重组质粒和pcDNA3.1+载体进行双酶切，然后使用DNA片段纯化试剂盒进行片段回收；

S3连接反应：通过T4 DNA连接酶连接将S2中的载体片段和外源基因片段，反应体系在16℃下连接8h；

S4转化：将JM109感受态细胞从-80℃超低温冰箱中取出，置于冰上溶解后，将S3中的接连产物加入，然后加入不含抗性的LB液体培养基，然后生化箱中培养，再进行PCR验证，获得阳性菌种；

S5质粒的大量培养及纯化：将S5中获得的阳性菌种在含有相应抗性的LB液体培养基中培养，然后在溶菌酶的作用下获得质粒溶液，质粒溶液加入纯化仪，得到纯化的质粒溶液；

S6质粒浓缩：S5中获得的质粒浓度为500ng/μL，对质粒进行浓缩后，将浓度分别调整为500ng/μL、1000ng/μL、2000ng/μL后于-80℃保存，获得mstn自体核酸疫苗。

在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，外源基因的重组质粒和载体双酶切体系包括：1.0μL Nhe I，1.0μL Xho I，≤2.0μg基因/质粒，2.0μL 10×buffer，不超过20.0μL ddH₂0，20.0μL Total Volume。在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，S2中使用DNA片段纯化试剂盒进行片段回收的方法包括以下步骤：

S201向PCR反应液中加入3倍体积的Buffer DC，然后均匀混合；

S202将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上；

S203将S201的溶液转移至Spin Column中，12000rpm、室温的状态下离心1min，弃滤液；

S204将700μL的Buffer WB加入Spin Column中，12000rpm、室温的状态下离心30s，弃滤液；