[发明专利]一种异喹啉生物碱的快速精准检测方法、应用及试剂盒

说明书

本发明为一种采用8‑羟基‑1，3，6‑芘三磺酸钠盐(HPTS)作为有机荧光探针快速、精准检测异喹啉类生物碱，特别是盐酸小檗碱的方法，及其在中药黄连生产工艺中的应用，以及一种异喹啉类生物碱快速检测试剂盒。

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种采用8-羟基-1，3，6-芘三磺酸钠盐(HPTS)作为有荧光探针，快速精准检测异喹啉类生物碱，特别是盐酸小檗碱的 方法，及其在跟踪黄连生产工艺中的应用，以及一种异喹啉类生物碱快速检测试 剂盒。

发明背景

异喹啉类生物碱是最大的一类生物碱。以异喹啉或四氢异喹啉为母核，根据 连接基团的不同，可分为：简单异喹啉类、苄基异喹啉类、阿朴菲类、双苄基异 喹啉类、小檗碱类、普罗托品类、吗啡类和苯菲啶类。异喹啉类生物碱具有多种 生物活性，如抗肿瘤、抗炎、镇痛、免疫调节和抗氧化作用等。

研究显示，黄连、黄柏的药理活性主要与其所含的多种季铵型异喹啉类生物 碱有关，包括盐酸小檗碱(以下简称小檗碱)、黄连碱、表小檗碱、巴马汀、药 根碱等，其中以小檗碱的含量最高。五种主要生物碱均具有季铵基团，在分子结 构特点上均属异喹啉类生物碱。

小檗碱是黄连、黄柏等中药材的主要活性成分之一，属于异喹啉类，特别是 单苄异喹啉类季铵型生物碱，具有抗菌、消炎、抗心律失常、降血脂、降血糖以 及抗肿瘤等多种药理活性。由于药源十分丰富，价格相对适中，不良反应少，小 檗碱作为一种广谱的抗菌药物被广泛用于现代制药行业。

小檗碱含量测定是衡量黄连质量的重要指标，其测定方法主要有高效液相色 谱法、SDS法、双波长薄层扫描法、化学发光法、毛细管电泳法和电化学分析法 等。一些传统的分析方法具有量化小檗碱的能力，但大多数方法需要昂贵的仪器， 复杂和耗时的操作步骤。

目前，大生产实践中，缺少一种快速、精准检测异喹啉类生物碱，特别是小 檗碱的方法。同时，荧光方法用于异喹啉生物碱，特别是小檗碱检测的研究也十 分有限，特别是工业化生产中的快速检测。

发明内容

本发明针对异喹啉生物碱实施快速精准检测的问题，采用荧光法，特别是有 机荧光探针法，基于荧光“开关”原理，对小檗碱进行快速检测。

本发明有动机地设计大量的、不同的有机荧光探针、无机荧光探针实验，筛 选、对比、优化。申请人对荧光素类、罗丹明类、香豆素类、苯并噻唑类等有机 类荧光探针和碳点、量子点、金纳米簇等无机类荧光探针进行了筛选。最终得到 了一种采用HPTS作为有机荧光探针快速精准检测异喹啉类生物碱的方法。

本发明建立小檗碱快速检测技术方法；确定工艺判定标准，将快速检测小檗 碱的方法应用于黄连生产工艺；跟踪并检测黄连提取各工序中的小檗碱的浓度； 为大生产提供能够快速精准检测小檗碱的试剂盒实物。

本发明从以下几方面进行了设计研究(1)从发光材料中筛选高量子产率和 长荧光寿命的有机探针；(2)建立小檗碱快速检测方法，并进行方法学考察；(3) 跟踪黄连生产工艺，验证检测方法，确定检测操作方法及工艺判定标准；(4)制 作成品检测试剂盒。

申请人发现，由于HPTS和小檗碱之间的静电相互作用和π-π堆积形成了复 合物导致HPTS荧光猝灭。HPTS对小檗碱的检测方法成本较低、灵敏度高、易 于观察且响应速度快，参见图1。

本发明HPTS速检测小檗碱的方法，具有量子产率高、荧光寿命长、易于可 视化且检测结果的准确度较高、成本较低的特点。

本发明检测方法对大生产中的黄连样品进行了实测，相较HPLC等其他检测 方法，检测时间大幅缩短，每个样品在荧光光度计中的检测时间低于1分钟，甚 至低于30秒，比HPLC方法缩短了约2个数量级。

本发明方法考虑了成本的经济性，适用于工业化大生产。