[发明专利]一种利用RNA干扰机制诱导多位点切割基因组实现选择性杀死细胞的RNA系统

说明书

本发明提供了一种利用RNA干扰机制诱导多位点切割基因组实现选择性杀死细胞的RNA系统，所述细胞杀伤系统包括以下几个部分：1.编码核酸酶CRISPR‑Cas9蛋白的mRNA；2.前体单链引导RNA(pre‑sgRNA)的合成RNA，所述前体合成引导RNA的含有与目标miRNA或siRNA完全互补的序列以及合成引导RNA(sgRNA)的序列；所述杀伤系统用于利用细胞特异性表达的miRNA或siRNA诱导CRISPR/Cas9切割基因组，从而实现细胞的靶向杀伤。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言涉及一种利用RNA干扰机制诱导多位点切割基因组实现选择性杀死细胞的RNA系统。

背景技术

RNA干扰机制

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由单链或双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi具有如下特征：1)RNAi是转录后水平的基因沉默机制；2)RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA；3)RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；4)RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点；5)dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21bp左右的siRNA，并由siRNA或者miRNA来介导mRNA切割。而且大于30bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；6)ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。

小干扰RNA(siRNA)

病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(大约21～23bp)，即siRNA(小干扰RNA，small interfering RNA)。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。

siRNA通常作为RNAi的工具被人工合成，但是后来发现很多生物包括线虫还有人类一些特殊的细胞也会合成内源性siRNA，以用于基因表达的调控。

微小RNA(microRNA,miRNA)