[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9技术获取Period基因突变位点的方法及用途

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种基于CRISPR/Cas9技术获取Period基因突变位点的方法及用途，通过sgRNA模板的合成和体外转录，每粒卵显微注射sgRNA/Cas9蛋白，显微注射后G0代突变检测突变的发生情况。本发明的方法成功发现了2个可用于敲除Period基因的靶标位点，对于Period在斜纹夜蛾体内的功能分析奠定了基础。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术获取Period基因突变位点的方法及用途。

背景技术

Period为作为人们发现并鉴定的第一个昆虫生物钟基因，研究发现它调节着昆虫的而各种生理行为，如Per基因的表达紊乱会扰乱蟋蟀的昼夜节律^[140]，影响苹果小卷蛾生殖系统精子的节律释放^[141]，会打乱家蚕的羽化和孵化行为^[142]以及影响着哺乳动物身体的饮食健康^[143]等。此外Per还与其他生物钟基因，联合执行功能，它们之间在功能可能还存在补偿关系。因而就需要全方位的研究生物钟基因在体能执行的功能，这样才能更好地为服务于人类和自然作出贡献。根据上述研究结果表明斜纹夜蛾两性交流活动存在明显的昼夜节律性特征，而部分生物钟基因的节律表达也反映出较为相似的特征，其中以生物钟基因Period的节律性最为相似，为进一步分析生物钟基因对斜纹夜蛾两性交流活动可能存在的调控机理。

斜纹夜蛾在长期危害农作物的过程中常表现出明显的昼夜节律，但目前关于这些节律活动的分子机制尚不明确。因此，深入了解斜纹夜蛾生物钟基因Per在斜纹夜蛾两性交流活动中作用，就必须首先通过基因编辑技术获取可以诱导Per基因突变的靶标点。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9技术获取Period基因突变位点的方法及用途，本发明成功发现了2个可用于敲除Period基因的靶标位点，对于Period在斜纹夜蛾体内的功能分析奠定了基础。

本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9技术获取Period基因突变位点的方法，具体包括如下步骤：

S1，sgRNA模板的合成和体外转录：

第一轮PCR：以CRISPR-Per1-F、CRISPR-Per2-F和CRISPR-R为引物，进行扩增，获得单一条带的产物，备用；

引物CRISPR-Per1-F，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；

引物CRISPR-Per2-F，基因序列如SEQ ID NO.2所示；

引物CRISPR-R，基因序列如SEQ ID NO.3所示；

第二轮PCR：以第一轮PCR得到的产物为模板，以引物sgRNA-F和sgRNA-R为引物进行扩增，纯化后进行体外转录sgRNA；

引物sgRNA-R，基因序列如SEQ ID NO.4所示；

引物sgRNA-F，基因序列如SEQ ID NO.5所示；

S2，显微注射和突变检测：

收集斜纹夜蛾卵，将S1中得到的sgRNA与Cas9蛋白混合后，记为sgRNA/Cas9，显微注射到斜纹夜蛾卵中，24小时后，提取总DNA，然后以提取的DNA为模板，利用引物Per-jc-F和Per-jc-R进行PCR扩增，检测突变位点；

引物Per-jc-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

引物Per-jc-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。