[发明专利]一种用于检测禽腺病毒I群12个血清型的RAA引物及其检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测禽腺病毒I群12个血清型的RAA引物及其检测方法，属于禽病毒检测技术领域。用于检测禽腺病毒I群12个血清型的RAA引物和探针组合中的引物和探针序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.3所示。本发明可以同时检测12种不同血清型的FadV；而且本发明仅需必要的试剂及等温扩增设备，操作简便，特别适用于基层养殖场的鸡群大规模检测，从而有利于实现对于鸡群FadV的净化。

技术领域

本发明涉及禽病毒检测技术领域，具体涉及一种用于检测禽腺病毒I群12个血清型的RAA引物及其检测方法。

背景技术

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)是一种DNA病毒，属于腺病毒科、腺病毒属。FAdV根据抗原性的差异被分为3个群，其中I群FAdV致病力最强，造成的经济损失最大。I群FAdV又分为5个亚群(FAdV A-FAdV E)、12个血清型(FAdV-1至7，FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9至11)。I群FAdV可引起鸡的疾病主要有包涵体肝炎(IBH)、心包积液综合征(HPS)和肌胃糜烂(GE)等病症。流行病学调查显示，近年来FAdV流行呈现多种血清型混合感染的特点，其中，血清4型FAdV(FAdV-4)、血清8a型FAdV(FAdV-8a)和血清8b型FAdV(FAdV-8b)是影响我国养禽业最为严重的三个血清型。

目前，对于I群禽腺病毒的诊断，主要方法有以下几种：一是采用鸡胚或者细胞进行病原分离。可采集病毒含量高的组织及排泄物，如病变肝、肾、法氏囊、粪便等部位的作为病料，将被感染的病料组织制成悬液接种到SPF鸡胚中，少数鸡胚在接种后48h开始发育停滞、胚体出血、出现死亡，大多数在3～6d内死亡，部分鸡胚在7d后死亡；细胞培养作为另一种培养方式，主要是将禽腺病毒接种到鸡肝癌细胞或原代肾细胞进行分离鉴定。二是采用琼脂凝胶沉淀试验。本试验在兽医临床上有广泛应用，适用于对感染FAdV鸡群进行抗体检查。先分离病鸡血清，37℃温箱培养24h以上，抗原、抗体特异性结合，形成抗原-抗体的复合物。结果判定时以是否观察到白色沉淀线为标准。三是酶联免疫吸附试验，该试验可检抗原或抗体，进行精确测定，目前ELISA用于禽腺病毒的检测已有不少研究。此外，聚合酶链式反应(PCR)技术和实时荧光定量PCR技术也被广泛应用于FAdV的病原学检测。通常取病禽的肝脏，提取病毒基因组后使用PCR仪器进行PCR反应，大量扩增目的基因片段，进行FAdV检测。目前已经建立了许多针对FAdV的PCR方法(袁万哲，2016)，并且扩增后，可通过限制性内切酶技术进行酶切，实现了对FAdV I群12个血清型的参考毒株进行区分的目的。综合来看，常规检测方法如ELISA、琼脂扩散试验的成本低、操作简单，但缺点是耗费时间较长，且敏感性较差，敏感性低于中和试验。PCR和荧光定量PCR技术灵敏度较高，但对试验仪器和操作人员提出了较高要求，不适用于临床现场的大规模检测。

重组酶介导扩增-侧向流层析技术(Recombinase-aid Amplification Lateralflow dipstick，RAA-LFD)是在重组酶介导扩增技术(Recombinase-aid Amplification)的基础上，将反应下游引物5’端用生物素(biotin)进行标记，并在反应体系中加入一个长度46bp～52bp的nfo探针，该探针的5’端用6-羧基荧光素(FAM)标记，距离5’端超过30bp的位置用四氢呋喃(THF)残基标记，3’端被磷酸化阻断，距四氢呋喃「THF」残基15bp以上。反应后形成带有双标记产物，用包被生物素和FAM抗体的侧流试纸条(Lateral flow dipstick，LFD)实现现场快速检测。RAA-LFD具有较高的灵敏度，可实现结果可视化，且基本无额外购买其他任何辅助装备，仅需39℃恒温装置即可，极端条件下采用一个保温杯即可完成反应得出试验结果，适合适合病原体现场快速筛查，尤其适合实验设备简陋地区和应急情况，该技术目前已经在多种病原检测领域中获得广泛应用。