[发明专利]表面展示碳酸酐酶的重组工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种表面展示碳酸酐酶的重组工程菌的构建方法；其特征在于，包括如下步骤：

(1)通过聚合酶链式反应(PCR)分别扩增编码冰核蛋白N端结构域(INPN)和碳酸酐酶(CA)的核苷酸序列；

(2)将INPN与CA通过酶切连接的方式进行融合，将融合后的CA表面展示模块以酶切连接的方式克隆至表达载体上，构建重组表达载体；

(3)将重组表达载体转化导入宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)中，通过菌落PCR或提取质粒后酶切筛选阳性重组菌，获得表面展示碳酸酐酶的重组工程菌。

2.根据权利要求1所述的一种表面展示碳酸酐酶的重组工程菌的构建方法；其特征在于，所述步骤(1)中碳酸酐酶选自Helicobacter pylori 26695的α型碳酸酐酶(HPCA)或Sulfurihydrogenibium azorense的α型碳酸酐酶(SazCA)。

3.根据权利要求1所述的一种表面展示碳酸酐酶的重组工程菌的构建方法；其特征在于，所述步骤(1)中编码冰核蛋白N端结构域(INPN)的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；碳酸酐酶(HPCA)的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；碳酸酐酶(SazCA)的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

4.根据权利要求1所述的一种表面展示碳酸酐酶的重组工程菌的构建方法；其特征在于，所述步骤(2)中融合方式包括：INPN与CA之间由冰核蛋白中间重复域中的前端两个亚重复序列(RE)连接，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；INPN与CA之间由连接子(FlexibleLinker，GGGGS)连接；INPN与CA之间由冰核蛋白的中间重复域中的前端两个亚重复序列和连接子进行融合连接。

5.根据权利要求1所述的一种表面展示碳酸酐酶的重组工程菌的构建方法；其特征在于，所述步骤(2)中表达载体包括：质粒pET-28a、融合有助溶蛋白TrxA的pET-32a和融合有PelB信号肽的pET-22b。

6.如权利要求1-5中任一项构建方法构建得到的表面展示碳酸酐酶的重组工程菌，其特征在于，包括HPCA表面展示工程菌：E-28a-I_LH，所含重组质粒p28a-I_LH的核苷酸序列为SEQ ID No.5；E-28a-I_RH，所含重组质粒p28a-I_RH的核苷酸序列为SEQ ID No.6；E-28a-I_RLH，所含重组质粒p28a-I_RLH的核苷酸序列为SEQ ID No.7和SazCA表面展示工程菌：E-28a-I_RLS，所含重组质粒p28a-I_RLS的核苷酸序列为SEQ ID No.8；E-22b-I_RLS，所含重组质粒p22b-I_RLS的核苷酸序列为SEQ ID No.9；E-32a-I_RLS，所含重组质粒p32a-I_RLS的核苷酸序列为SEQ ID No.10。

7.如权利要求5所述的表面展示碳酸酐酶重组工程菌制备全细胞催化剂，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将获得的表面展示碳酸酐酶的重组工程菌接种到培养基中，过夜培养以活化菌体；

(2)将种子液转接到新的培养基中，振荡培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.2-1.0mM的诱导剂IPTG和终浓度为0.0-2.0mM诱导剂ZnSO₄，于15-37℃继续培养6-60h诱导碳酸酐酶表达。

(3)将诱导完成后的菌液在冷冻离心机中，4-8℃，6000-9000rpm离心7-10min收集菌体，用去离子水至少洗涤两次，用Tris-HCl缓冲液至少洗涤两次后，将菌体悬浮于5-15mLTris-HCl缓冲液中得到全细胞催化剂样品。