[发明专利]一种增加番茄果实重量及心室数目的基因及其调控方法

权利要求书

1.一种增加番茄果实重量及心室数目的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。

2.一种增加番茄果实重量及心室数目的基因调控方法，其特征在于：包括下列步骤：

步骤1：以番茄cDNA为模板，以上游引物-F和下游引物-R进行PCR扩增，PCR扩增产物纯化后，得到目的基因片段；

上游引物-F：5’- tacggtacctctagaggatccTAATCCTAAATGGAACCGGC-3’；

下游引物-R：5’- aacatcgtaaggatactcgagTTCTGAGTGAAGCATCTTAC-3’；

步骤2：用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶XhoI对载体pBI121进行双酶切，酶切产物纯化后，得到线性pBI121载体；

步骤3：目的基因片段和线性pBI121载体进行重组，得到LCD1-pBI121质粒；

步骤4：将LCD1-pBI121质粒转化EHA105农杆菌感受态细胞；

步骤5：含有LCD1-pBI121质粒的EHA105农杆菌侵染番茄子叶并获得转基因阳性苗。

3.根据权利要求2所述的增加番茄果实重量及心室数目的基因调控方法，其特征在于：步骤1中，PCR扩增体系为50 μL：番茄cDNA2μL、上游引物-F和下游引物-R各2μL、5×高保真DNA聚合酶缓冲液10μL、高保真DNA聚合酶1μL、脱氧核糖核苷三磷酸dNTP混合物1μL、双蒸水补至50 μL。

4.根据权利要求2所述的增加番茄果实重量及心室数目的基因调控方法，其特征在于：步骤1中，PCR扩增参数为：预变性94℃，5min；变性94℃，30s；退火50℃，30s；延伸72℃，2min，32个循环；末次延伸72℃，5 min。

5.根据权利要求2所述的增加番茄果实重量及心室数目的基因调控方法，其特征在于：步骤2中，双酶切体系为50μL：100ng的载体pBI121100ng、5μL的10×Cutsmart Buffer、限制性内切酶BamHI和限制性内切酶XhoI各1.5μL、双蒸水补充至50 μL，冰上混匀后放入37℃水浴反应1-2 h。

6.根据权利要求2所述的增加番茄果实重量及心室数目的基因调控方法，其特征在于：步骤3中，目的基因片段和线性pBI121载体用一步克隆试剂盒ClonExpressⅡ One StepCloning Kit进行重组，重组条件为：37℃连接30min，结束后置于冰上保存；取步骤1得到的PCR扩增产物加入到100µL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上静置30 min，42℃热激45s，冰浴2-3min；在离心管中加入700µL的LB液体培养基，置于37℃，150rpm摇床中振荡培养45min；培养得到的菌液4000rpm离心2min，弃上清200µL，吸取剩余菌液均匀涂布于含有卡那霉素抗性的固体培养基，37℃倒置培养16h；挑取单克隆菌落，于10µL无菌水中吹吸混匀，取2µL菌液进行菌落鉴定。

7.根据权利要求6所述的增加番茄果实重量及心室数目的基因调控方法，其特征在于：进行菌落鉴定时，菌落PCR扩增体系为25µL：2µL菌液、0.5µL上游引物-F、0.5µL下游引物-R、12.5µL的2×DNA聚合酶混合体系、9.5µL双蒸水，冰上混匀；PCR扩增参数为：预变性95℃，3min；变性95℃，15s；退火58℃，15s，延伸72℃，90s，35个循环；彻底延伸72℃，5min；4℃，60min；待反应结束后，产物经琼脂糖凝胶电泳，检测条带大小是否符合结果，将条带位置正确的单克隆扩大培养，即在菌液中加入LB液体培养基5 ml，并加入25µL 的浓度为10mg/mL卡那霉素后混匀，37℃，200 rpm摇床中振荡培养12-16h，然后提取菌液中的质粒，并将提取的质粒于-20℃保存。