[发明专利]七种RNA病毒核酸检测质控品及其制备方法

说明书

本发明公开了七种RNA病毒核酸检测质控品及其制备方法，属于临床检验学和应用分子生物学领域。本发明具有序列表SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列。本发明采用优化的MS2噬菌体病毒样颗粒包装技术，分别将七种RNA病毒的重组常规检测区域序列包裹至MS2衣壳蛋白中，制备了七种病毒的MS2病毒样颗粒核酸检测质控品。质控品充分模拟天然病毒粒子结构、性能稳定、耐核酸酶、无任何传染危险性，实现从核酸提取、逆转录及扩增检测的全流程的质量监控和评估。该质控品通用性好，检测区域广泛，适用于常规检测方法和多种检测试剂盒的质量控制，克服了不同试剂盒不能共用质控品的难题。

技术领域

本发明涉及七种RNA病毒核酸检测质控品及其制备方法，属于临床检验学和应用分子生物学领域。

背景技术

急性呼吸道感染的患者常出现发热、咳嗽、流涕等症状，部分患者(如儿童、患有基础疾病以及免疫力低下的患者)中，常引发严重的肺炎、支气管炎等并发症，是5岁以内儿童死亡的主要原因。临床上引起急性呼吸道感染的病原体种类较多，其中80％是病毒感染，主要包括流感病毒(Influenza virus，IFV)、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytialvirus，RSV)、副流感病毒(Parainfluenza virus，PIV)、鼻病毒(Human rhinovirus，HRV)等。柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16，CA16)和肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)则是常见的导致儿童手足口病的重要病毒，二者所致的手足口病临床难以区分，且严重时还可引起患者出现脑炎、脑膜炎等并发症。由于不同病原体感染在患者治疗方式以及临床预后等方面存在一定差异，因此快速且准确对病原体进行鉴定对临床早期诊断和治疗具有指导意义，也能有效防止病原体在人群中的进一步传播。

目前，对病毒基因组特异核酸序列进行扩增检测的分子检测技术(如实时荧光逆转录PCR、多重PCR等)具有快速、灵敏等优势，极大的提高了病毒检测的敏感性和特异性，且同时具备优越的病毒定量和分型鉴定的能力，目前已成为实验室病毒检测的主流技术。但是，在实际检测过程中，PCR方法的敏感性及特异性非常依赖于样本中目标核酸提取的效率、引物和探针设计的特异性、酶扩增反应条件设计的合理性等。因此，用于核酸检测质量控制的性能稳定、特征明确的质控品是不可或缺的。

现阶段，RNA病毒的核酸检测质控品主要来源于质粒、体外转录的RNA、临床标本培养的病毒样本、慢病毒病毒样颗粒以及MS2病毒样颗粒。实验室内部或者商业试剂盒通常采用质粒或体外转录的RNA作为质控品，然而此类质控品无法模拟核酸提取的过程，无法对提取效率进行评估，且质粒也无法评估逆转录过程，裸漏的RNA质控品也具有不稳定，容易降解等缺点。临床标本培养的病毒样本虽然能模拟从核酸提取到检测的全过程，但具有生物传染危险性且不易大量获得。来自慢病毒包装的病毒样颗粒可以评估核酸提取过程，也进一步降低了病毒感染的风险，但同时也具有产率较低、培养花费大、潜在的感染风险等问题。而采用MS2噬菌体病毒样颗粒包装技术制备的MS2病毒样颗粒仅由MS2病毒蛋白衣壳和内部包裹的核酸片段组成，且通过构建原核表达系统可实现对外源RNA序列的包装。该MS2病毒样颗粒性能稳定，其外部衣壳蛋能保护内部包裹的RNA不被降解，能够在模拟整个检测过程的同时排除生物传染的风险，是理想的RNA病毒模拟参考材料，适用于常见RNA病毒(如：呼吸道合胞病毒、鼻病毒、副流感病毒、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型等)核酸检测质控品的制备。

但是采用常规的MS2噬菌体病毒样颗粒包装技术制备的病毒样颗粒，其所插入的外源序列的大小具有限制性，当长度超过500bp时，其包装效率快速下降，病毒样颗粒的产率大大降低，产物浓度较低，仅约为10⁶copies/mL。同时，由于不同试剂盒检测靶区域的不同，现有的质控品的应用范围受到限制，一种质控品仅能适用于其相对应的检测试剂盒，导致目前各类试剂盒的质控品难以共用。因此，制备能高效表达且应用范围广泛的安全、可靠的RNA病毒质控品具有重要意义。

发明内容