[发明专利]一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用

说明书

本发明公开了一种活性提高的酯酶突变体Est8‑XL及其应用，所述酯酶突变体Est8‑XL氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。采用易错PCR和基于溴麝香草酚蓝(Bromothymol blue,BTB)指示剂颜色变化的高通量筛选方法，通过三轮筛选从而获得活力提高的突变酯酶Est8‑XL。突变酯酶Est8‑XL较野生酯酶Est8对7‑氨基头孢烷酸的脱乙酰化活性得到了提高，在pH9.5到10.0缓冲液中的活性和在10mM的NaCl、KCl、LiCl、CuSO₄、NiSO₄和ZnSO₄溶液中的活性得到了提高。本发明的突变酯酶Est8‑XL可用于生物医药技术领域。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用。

背景技术

我国是抗生素使用大国，也是抗生素生产大国。头孢菌素类抗生素是国内外抗生素类药物中最大的家族，因具有高效、低毒、广谱和耐β-内酰胺酶的优点，在医疗领域具有重要的作用。但由于抗生素的过度使用，面临着耐药细菌蔓延的严重问题，因此新型抗生素的发展已是大势所趋。

合成新型抗生素的中间体去乙酰基-7-氨基头孢烷酸(Deacetyl-7-amino-cephalosporic acid,D-7-ACA)可在脱乙酰化酶的作用下脱去3-位上的乙酰基生成。以D-7-ACA(Deacetyl-7-amino-cephalosporic a cid,D-7-ACA)作为合成抗生素的中间体，不仅能够合成新型的抗生素，而且相比7-ACA还可以提高生产企业的经济效益。传统合成D-7-ACA的方法为化学裂解法，但存在成本高、工艺流程繁琐和环境污染等问题。新型酶法具有底物专一性，操作简便和对环境友好等优点，对生产D-7-ACA具有良好的发展前景。

酯酶广泛存在于动植物和微生物中，是一类能够催化酯水解、酯形成和酯交换的酶。微生物来源的GDSL家族酯酶没有靠近蛋白序列中部的G-x-S-x-G基序而是拥有GDSL基序，具有更灵活的催化位点，能够随着不同底物的存在和结合而改变自身的构象。现在关于GDSL家族酯酶的研究多集中于植物和动物，关于微生物来源的较少，对其催化作用机制研究还不那么完整。

申请人前期获得了来源于微生物(Bacillus sp.K91)的酯酶Est8(属于GDSL家族)，其生成的D-7-ACA能够为头孢菌素类抗生素的合成提供新型的中间体，但是该酶催化7-ACA生成D-7-ACA的活性较低。

发明内容

本发明针对上述存在对头孢菌素类抗生素新型中间体的迫切需求的问题，旨在提供一种GDSL家族脱乙酰化活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用。

为了实现上述技术目的，本发明具体采用以下技术手段：

一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL，所述酯酶突变体Est8-XL通过嗜热芽孢杆菌K91(Bacillus sp.K91)酯酶Est8定向突变得到，所述酯酶突变体Est8-XL氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

本申请酯酶突变体Est8-XL和野生酯酶Est8相比，对功能底物7-氨基头孢烷酸的脱乙酰化活性从2.71U/mg提高至4.47U/mg。

其中野生酯酶Est8的氨基酸和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

在本发明的另一方面，提供了所述酯酶突变体Est8-XL的编码基因，所示编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明另一方面，所述酯酶突变体Est8-XL通过以下方案制备得到：

1)将如SEQ ID NO.2所示基因与表达载体pEASY-E2相连接，将重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，获得重组菌；