[发明专利]一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法

说明书

本发明适用于一种组织样本的高分辨率空间组学检测装置、系统和方法，提供了一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测的装置、系统和方法，分别包含：一种带有可容纳微载体的微井反应室阵列的玻片，一种修饰核酸分子标识符的方法和一种在捕获组织样本空间组学信息过程中降低组学信息交叉污染的方法。采用本公开的空间组学检测方法，显著提高了空间组学检测的分辨率，降低了检测成本，同时从根本上降低了空间组学信息的交叉污染。

技术领域

本发明主要涉及一种组织样本的高分辨率空间组学检测装置、系统和方法，尤其涉及一种用于组织样本的高分辨率空间组学检测方法。

背景技术

人体组织是由数万亿个细胞组成的高度复杂的系统，它们在种类、时间和空间上各不相同，比如哺乳动物大脑不同区域的组织具有不同的功能和细胞类型，此时组织的空间异质性检测显得尤其重要。空间组学是指在组织切片上完成，保留样本空间信息的组学研究。空间组学可展示组织切片中不同区域的基因表达情况，揭示精细病理区域中激活的信号通路，完成分子特征驱动病理特征的机制解析。空间组学完成了病理数字化结合病理影像化的技术革新，对于诊断标志物、耐药位点以及靶向药物的研发，免疫治疗等新兴领域都具有重要作用。

空间组学检测方法主要可以分为四种，分别为结合计算策略和组学实验的空间重构法、基于激光显微切割的直接测量法、基于荧光探针及图像处理的原位组学法和基于寡核苷酸空间条形码的原位捕获技术。

空间重构法通过整合组织中单细胞转录组数据获取细胞的内在基因表达趋势及细胞之间的联系，但其只能呈现空间趋势或特定组织的总体布局。基于LCM的空间组学技术可以实现单细胞分辨率的组学测序，然而该技术检测通量较低，适用于局部组织空间组学检测。基于荧光探针和图像处理的原位组学法包括原位测序(in situ sequencing，ISS)和原位杂交(in situ hybridization，ISH)两种方式，这些方法在检测分辨率方面有突出的表现，可以实现亚细胞分辨率水平的空间组学测试，然而此类方法对检测技术要求高，需借助高灵敏度的单分子荧光成像系统，并且检测需要经历复杂的单分子杂交和图像分析过程，这显著增加了空间组学测试的成本和时间，目前仍然停留在实验室应用范围。

基于寡核苷酸空间条形码的原位捕获技术主要包含采用荧光解码的微球组装技术和10×Genomics公司的喷墨点样方法。前者将修饰有随机编码序列的微球紧密堆积于玻片表面，采用荧光解码技术实现微球序列的解码和定位，这种方式虽然提高了捕获序列的空间编码分辨率，但仍依赖于复杂且昂贵的单分子荧光成像系统，且该方法的寡核苷酸捕获效率较低，难以实现高密度序列的空间组学检测。目前，使用最为广泛的空间组学测试方法为10×Genomics公司的Visium产品，该产品采用喷墨点样方法在玻片表面制备了高通量的寡核苷酸捕获序列，当组织样品贴附于该玻片表面上后，对组织进行透化处理，在此过程中组织样本的待测序列被寡核苷酸序列原位捕获，经过反转录及第二代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)后，实现了组织样品空间组学测序。该方法与前几种方法相比具有测序成本低、时效高、易操作等优势，目前，基于该方法的10×Visium产品已成功商品化，其应用范围已涉及多个重要研究领域。

然而，10×Visium仍有几个重要问题亟待解决：第一，玻片表面的寡核酸序列阵列是采用喷墨点样技术制备的，目前该技术在玻片上所制备阵列尺寸的最高分辨率为55μm，每个序列点阵对应十几至数十个细胞的空间组学信息，这限制了其在组织样本中单细胞空间组学分析及细胞间相互作用机制的探究，也可能导致重要信息的遗漏；第二，采用喷墨点样方法制备寡核酸序列阵列时会出现点样不均一的现象，导致寡核苷酸序列区域之间的修饰效果产生差别，甚至会出现漏点的情况，即目标区域内没有被点上样品。第三，采用该产品进行序列抓捕过程时，透化液在促使组织样本中序列渗出的同时也使序列发生横向扩散，导致组织空间序列信息发生交叉污染，特别是在高分辨率空间组学测序过程中，这种现象尤为严重。第四，这种方式需要对阵列中每个位置的寡核苷酸捕获序列分别进行全长合成，而大批量的寡核苷酸合成增加了该产品的成本和设计复杂程度。