[发明专利]一种制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法

说明书

本发明涉及植物空间转录组学领域，主要涉及到一种制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法。所述方法包括步骤：将在冰上预冷后的OCT注入包埋盒，将新鲜棉花胚组织放入装有OCT的包埋盒中，再用OCT覆盖暴露的组织表面；OCT完全冻结后进行切片和制片。本发明方法利用新鲜组织快速低温包埋后切片，获得了结构清晰、完整的冰冻切片，并可用于空间转录组学，得到一个完整的组织样本中产生的全部转录组数据，能够定位和区分功能基因在特定的组织区域内表达情况。根据差异基因的表达情况分析调控细胞群命运、空间组织、集体生长的关键因子，空间基因表达模式的详细分析对于阐述植物发育过程中复杂的调控网络至关重要。

技术领域

本发明涉及植物空间转录组学领域，主要涉及到一种制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法。

背景技术

组织系统由不同的细胞亚群组成，它们在特定组织中的空间位置与它们的功能紧密交织在一起。了解组织系统需要了解它们的组成部分。尽管单细胞RNA测序(scRNA-seq)是解决转录异质性的有力工具，这种单细胞分析的应用极大地促进了发育过程的实验研究。然而，在scRNA-seq必要的组织解离步骤中分离单个细胞会破坏有关它们在天然组织中的空间定位以及它们彼此接近的信息，这种空间信息对于理解正常和胁迫组织下的细胞间通讯是至关重要的。为了克服这些不足，空间转录组学(ST)允许将RNA-Seq转录本数据空间映射到高分辨率组织图像上，空间信息通过使用由1000个点(100-μm圆形区域)和条形码捕获探针组成的独特微阵列来保持。空间转录组学(ST)可以揭示出丰富的不同基因组的生态位。这将细胞亚群定位到它们所在的组织“邻里”，并指定它们表达的配体和受体，以影响局部细胞间的通讯。当空间转录组学和单细胞RNA测序(scRNA-seq)联合使用时，可以在其天然组织环境中定位转录特征的单个细胞。ST已经被用于研究小鼠嗅球，乳腺癌，黑色素瘤，前列腺癌，牙龈组织，成人心脏组织，小鼠以及模式植物。

与哺乳动物系统相比，植物组织和细胞面临着许多特殊的挑战，包括植物细胞壁、液泡、叶绿体和次生代谢物。这些特性需要与哺乳动物组织相比有很大不同的操作程序，并且通常需要针对物种或组织进行特定的优化。在进行空间转录组学分析时，冷冻切片的制作至关重要。组织切片的质量和完整性直接决定了空间转录组数据的准确性。

按照现有文献报道的关于植物组织冰冻切片方法进行了棉花胚珠的切片，发现经过液氮速冻后的棉花组织十分脆弱，经包埋固定后切片效果不理想，大部分冰冻切片中棉花胚珠破碎，失去完整性。分析其原因，与现有报道的关于植物冰冻切片方法相比，可能是因为棉花胚珠组织中子房壁、胎座等结构相关，这些结构在不同厚度切片下，形态存在差异。另外，棉花胚珠含有木质素，在冰冻状态下也可能导致组织脆弱。目前关于用于空间转录组学分析的植物组织冰冻切片的方法还不完善，没有成熟的技术体系用于制备空间转录组学分析所需的植物组织冰冻切片。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法。

根据本发明的制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法包括以下步骤：

5)取新鲜取棉花胚组织，修剪成合适大小的组织块，清洗干净并吸干水分，置于培养皿中；

6)将在冰上预冷后的OCT注入包埋盒，将新鲜棉花胚组织放入装有OCT的包埋盒中，再用OCT覆盖暴露的组织表面，确认在组织附近没有气泡，将含有棉花胚组织和OCT的包埋盒进行冷冻凝固；

7)切片：OCT完全冻结后进行切片，将样品托固定到冰冻切片机的预冷样品托持承器上，进行切片，切片厚度为8-10μm；

8)制片：将切片平展于速冻台上，调整切片的角度，将切片贴在空间转录组专用的玻片上，得到用于棉花胚珠空间转录组分析的切片。

根据本发明的制备用于棉花胚珠空间转录组分析的切片的方法，其中，在步骤1)中，修剪棉花胚组织的大小为6.5mm×6.5mm。