[发明专利]PET水解酶IsPETase突变酶及编码基因及工程菌

说明书

本发明公开了PET水解酶IsPETase突变酶及编码基因及工程菌，PET水解酶IsPETase突变酶，命名为IsPETase^R280A/S121K‑cSP，所述IsPETase^R280A/S121K‑cSP的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。本发明采用理性设计技术对PET水解酶IsPETase进行分子改造，经过信号肽预测、同源建模等方法而获得水解效率提高的PET水解酶IsPETase突变酶即IsPETase^R280A/S121K‑cSP，使对PET水解效率提高，同时，采用PET水解酶IsPETase突变酶和MHETase‑cSP联用，使对PET水解效率提高。

技术领域

本发明属于酶工程和生物工程技术领域，具体涉及一种PET水解酶IsPETase突变酶及编码基因及含有编码基因的质粒及工程菌。

背景技术

随着全球塑料产量的持续增长，2018年产量已高达3.59亿吨，过去十年复合增速达到4.1％。目前生产的主要塑料聚合物类型包括聚乙烯(PE)，聚丙烯(PP)，聚氯乙烯(PVC)，聚对苯二甲酸乙二酯(PET)，聚氨酯(PUR)和聚苯乙烯(PS)。其中，PET是最丰富的聚酯塑料。

PET由取自原油的对苯二甲酸(TPA)和乙二醇(EG)通过酯键相连构成。PET具有合成简单、价格低廉、坚固耐用等特性，PET产品包括纤维级PET和非纤维级PET(如瓶类、薄膜和工程塑料等)，包装是PET最大的非纤维级应用市场，也是增速最快的领域。目前大部分瓶装水、软饮料都使用PET进行灌装；PET在食品、药品、化妆品和日用化学品包装等领域也得到更广泛的应用。因此带来的巨大经济效益，推动了其市场份额快速增长。2015年全球PET产量为8500万吨，主要用于生产包装材料和饮料瓶。

PET具有高比例的芳香族对苯二甲酸酯单元，会降低链迁移率，因此是一种极难水解的聚酯，在自然界中可存在16-48年。目前，PET塑料主要处理方法是填埋、焚烧、热解和化学降解，均存在对环境二次污染，而且超4000万吨/年PET塑料被遗弃/填埋至自然界中，造成全球污染极其严重。

使用酶或微生物降解合成塑料聚合物将是消除这种浪费的更环保的措施，迄今为止，已经鉴定出许多PET水解酶，酯酶、脂肪酶或角质酶形式的PET水解酶是研究最广泛的塑料降解酶。其中，酯酶的效力最低，这种限制是由于酯酶底物结合口袋的体积有限。类似的脂肪酶对PET水解的活性较低，这是由于疏水活性位点被盖子结构覆盖而阻止了底物直接进入酶。角质酶是用于PET水解的最有效的酶，因为角质酶具有较大的底物结合槽，并且角质酶的催化中心不存在“盖子”结构，有助于酶识别PET聚合物底物，因此角质酶及其同系物相较其他酶表现出较高的降解能力。

然而，这些酶由于其低PET降解能力和高反应温度(约70℃)而受到限制。2016年，日本团队发现一种将PET作为主要能量和碳源的细菌Ideonella sakaiensis 201-F6，随后从中鉴定出PET水解酶PETase和MHETase，该酶与具有PET水解活性的角质酶有很高的序列相似性(约50％)。但因为IsPETase仅在温和的条件下生长，其相对较低的稳定性和酶活性也限制了其在PET降解中的应用。为了提高水解效率，IsPETase需要进行异源表达和理性设计以对其进行蛋白质工程改造。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种表达稳定，酶活性和热稳定性高，使水解效率提高，适用于规模化应用的PET水解酶IsPETase突变酶。

本发明的第二个目的是提供一种编码PET水解酶IsPETase突变酶的基因。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述基因的重组质粒。

本发明的第四个目的是提供一种含有上述重组质粒的工程菌。

本发明的第五个目的是提供上述工程菌在水解PET中的应用。

本发明的技术方案概述如下：