[发明专利]一种新型核酸分子检测与定量技术

说明书

本发明涉及一种适配体核酸分子，包含该适配体和荧光团小分子的复合物，该适配体核酸分子用于检测细胞内或者细胞外的RNA、DNA或者其他靶分子的方法，以及包含该适配体的试剂盒。本发明的适配体可以特异性结合一种荧光团小分子，并显著提高其在合适波长光激发下的荧光强度。

技术领域

本发明涉及一种适配体核酸分子，该适配体核酸分子用于检测细胞内或者细胞外的RNA、DNA或者其他靶分子的方法，以及包含该适配体的试剂盒。本发明的适配体可以特异性结合一种荧光团小分子，并显著提高其在合适波长光激发下的荧光强度。

背景技术

在活细胞中，RNA具有独特的结构、种类繁多的生物学功能以及复杂的时间空间分布。对不同种类的RNA及其修饰形式的鉴定、功能与调控研究现已经成为了国际前沿。开发技术对它们进行实时示踪和分析，对于理解各种细胞生命过程至关重要。

目前，对于RNA成像的比较成熟的技术手段，主要有以下几种，RNA荧光原位杂交技术、分子信标技术、RNA结合蛋白-荧光蛋白MCP-FPs系统和荧光RNA技术。其中，RNA荧光原位杂交技术是长期以来被广泛用于来研究RNA在细胞内水平与分布的方法，它是通过分子杂交对特异RNA分子进行荧光标记，进而进行成像的技术。然而其操作较复杂且含有洗脱步骤，只能用于固定化细胞即死细胞的研究，不能用于实时监测活细胞中RNA的动态变化过程。而分子信标技术是最早发展起来的活细胞RNA成像技术。它是一种在5’和3’末端自身形成发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，当其与靶标RNA结合后，标记在一端的猝灭基团对荧光基团的猝灭作用消除，荧光基团产生荧光，或者两端荧光基团的FRET消失。然而分子信标存在着荧光信号偏低、进细胞困难、易降解、较严重的细胞核内非特异性聚集、易受RNA二级结构的影响且需要对每条RNA专门定制寡核苷酸探针等缺点，这些缺点限制了该技术的广泛应用。目前用于活细胞RNA成像的方法主要是利用MCP-FPs系统，MCP-FPs可以特异性识别结合融合了多拷贝MS2序列的mRNA分子，通过检测荧光蛋白的信号实时监测mRNA的合成及分布(Ozawa et al.Nature Methods.2007.4:413-419)。但由于未结合mRNA分子的MCP-FPs会产生很高的本底荧光，使得该方法的信噪比很低。随后，科学家们将MCP-FPs融合蛋白加上核定位信号，使得没有与mRNA分子结合的GFP-MS2定位细胞核中，一定程度降低了细胞胞浆中的非特异荧光，提高了检测的信噪比。

2003年.荧光蛋白的诺贝尔化学奖获得者之一钱永健(Roger Tsien)教授提出可以利用RNA适配体特异性识别结合并激活染料分子，进而实现对RNA的可视化。基于这样的原理，他的课题组筛选获得了可以结合并激活三苯甲烷染料孔雀石绿(MG)染料分子，荧光增强倍数可达2360倍。可惜的是，由于MG本身是生物染色剂，因而不能用于活细胞RNA标记。受这一发现的鼓舞和启发，在过去的十多年里，科学家们还发展了其他的RNA适配体-荧光团复合物，包括基于Hoechst衍生物、花菁类染料、荧光团-猝灭基团(FQ)以及荧光蛋白生色团衍生物的荧光RNA。相比较其他RNA成像技术，人们只需要将RNA适配体编码序列与靶标RNA编码序列融合表达，加入染料分子即可对RNA标记成像，无需引入其他核酸活蛋白质分子，因此是最直接的一种RNA成像方法，也是最有希望成为理想的活细胞RNA标记与成像技术。