[发明专利]过表达N-糖基化途径调节基因以调节重组蛋白的糖基化

权利要求书

1. 一种在哺乳动物细胞培养过程期间调控重组蛋白的高甘露糖糖型含量的方法，其包括转染宿主细胞以过表达涉及N-糖基化途径的蛋白质，其中所述涉及N-糖基化途径的蛋白质选自N-乙酰基-葡萄糖胺转移酶-1(由Mgat1编码)；N-乙酰基-葡萄糖胺转移酶-2(由Mgat2编码)；UDP-半乳糖转运蛋白，其由Slc35a2编码；及其组合；

使转染的哺乳动物宿主细胞生长，从而产生转染的哺乳动物宿主细胞；和

(a) 使转染的哺乳动物宿主细胞经受温度变化；或

(b) 通过L-天冬酰胺饥饿随后用具有5 mM或更少的L-天冬酰胺浓度的无血清灌流培养基灌流来诱导转染的哺乳动物宿主细胞进入细胞生长停滞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述温度变化为36℃至31℃，或36℃至33℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其中哺乳动物细胞培养过程包括生长期和生产期，其中温度变化发生在生长期与生产期之间的过渡处，或在生产期期间发生。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述灌流培养基具有选自以下的L-天冬酰胺浓度：

(a) 4.0 mM或更少；

(b) 3.0 mM或更少；

(c) 2.0 mM或更少；

(d) 1.0 mM或更少；和

(e) 0 mM。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中转染所述宿主细胞以表达两种或更多种涉及所述N-糖基化途径的蛋白质，其中所述蛋白质选自Mgat1和Mgat2；Mgat1和Slc35a2；Mgat2和Slc35a2；以及Mgat1、Mgat2和Slc35a2。

6.根据权利要求5所述的方法，其中转染所述宿主细胞以表达Mgat1和Mgat2。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞系先前已经过转染以表达重组蛋白，并且随后进行转染以表达涉及N-糖基化途径的蛋白质。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞系首先用涉及N-糖基化途径的蛋白质转染，随后进行转染以表达重组蛋白。

9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白是包含抗体Fc区的蛋白质、Fc融合蛋白、抗体、免疫球蛋白和肽体。

10.根据权利要求1–4中任一项所述的方法，其中在经过转染以过表达涉及N-连接糖基化的蛋白质的所述细胞中表达的重组蛋白的高甘露糖糖型含量与由所述细胞未通过转染以过表达涉及N-连接糖基化的蛋白质进行操控的培养物产生的所述重组蛋白相比是减少的。

11.根据权利要求10所述的方法，其中重组蛋白的高甘露糖糖型含量小于或等于10%。

12.根据权利要求10所述的方法，其中重组蛋白的高甘露糖糖型含量小于或等于5%。

13.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养过程利用补料分批培养方法、灌流培养方法及其组合。

14.根据权利要求13所述的方法，其中使用交替式切向流(ATF)灌流所述培养物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中灌流开始于所述细胞培养的第1天或大约第1天至第9天或大约第9天，或其中灌流开始于所述细胞培养的第3天或大约第3天至第7天或大约第7天。

16.根据权利要求14所述的方法，其中灌流在细胞已到达生产期时开始。