[发明专利]一种用于快速筛选瓜氨酸降解菌的简并引物及其应用

说明书

本发明公开了一种用于快速筛选瓜氨酸降解菌的简并引物，其序列为：PTP1‑F:5’‑NACHACHGGCCAHACRAA‑3’;PTP2‑R:5’‑GTHGAYATHATGGTMTTYAT‑3’;其中，简并碱基代码Y=C/T，R=A/G，H=A/C/T，B=G/T/C，N=A/G/C/T。本发明还公开了设计出的简并引物在筛选瓜氨酸降解菌方面的应用。本发明首次依据具有瓜氨酸利用能力的PTP基因设计出一对简并引物，该简并引物为具有筛选功能的通用引物，无须针对某一菌种设计特定的探针引物，方便快捷，通用性好，工作效率高，具有良好的筛选和鉴定功能；为后续探究不同菌种来源的PTP基因利用瓜氨酸能力大小的差异和受环境因素影响大小的比较提供菌种保障，为减少或消除发酵过程中生成的氨基甲酸乙酯提供了新的解决思路和方法。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种用于快速筛选瓜

氨酸降解菌的简并引物，本发明还涉及利用该简并引物筛选瓜氨酸利用菌种的方法。

背景技术

瓜氨酸（Citrulline, CIT）是一种非编码型α-氨基酸，它对于人的健康具有极其重要的影响。瓜氨酸涉及到人类的一系列生理代谢过程，因而受到了营养学和医学界的广泛关注。但随着近年来研究的不断深入，瓜氨酸被发现会给发酵食品带来严重的安全隐患。

瓜氨酸和乙醇的自发反应被认为是多种酒精饮料（如葡萄酒等）及发酵调味品（如酱油等）中生成氨基甲酸乙酯的主要途径。氨基甲酸乙酯（简称EC，又称脲烷、乌拉坦）在人体内代谢过程中被转化为N-羟基-氨基甲酸乙酯或乙烯基氨基甲酸乙酯，进而造成碱基颠换或碱基对置换，使DNA损坏而诱发癌变，故而氨基甲酸乙酯在2007年由国际癌症研究机构认定是一种2A类致癌物。2002年，联合国粮农组织制定了国际标准，氨基甲酸乙酯的含量不得超过20μg／L。

近年来，随着人们食品安全意识的增强，对食品中EC的关注度逐渐提升，EC也成为了国外限制我国发酵食品和酒精饮料出口的重要贸易壁垒，EC的产生机制及消除策略逐渐成为近年来食品发酵工业的研究热点。由于EC是一种非常稳定的化合物，一旦形成，极难再被降解。因此，对EC最有效的消除策略就是在EC产生前对其前体物进行控制或直接消除。

作为发酵过程中EC产生的主要前体物，瓜氨酸并非常见氨基酸，它不在蛋白质合成中发生作用，因此发酵过程中通过蛋白质水解不能直接获得瓜氨酸。但是，一些细菌，尤其是乳酸菌，能够通过精氨酸脱亚氨基途径（Arginine deiminase pathway, 简称ADIpathway）将精氨酸转化为瓜氨酸，并释放到环境中。

研究发现，一些细菌在arc基因簇（编码ADI途径关键功能蛋白）下游，存在着一个编码未知功能转运蛋白（putative transport protein）的基因，目前推测此转运蛋白与胞外瓜氨酸的转运有关。通过对Lactobacillus sakei CTC494中编码该putative transportprotein的PTP基因进行敲除，发现Lactobacillus sakei CTC494失去了再利用环境中瓜氨酸的能力，从而确定了该基因与胞外瓜氨酸的利用有关，且不同菌种的PTP基因表现出降解瓜氨酸的能力大小差异。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能精确、快速筛选具有PTP基因

，即具有瓜氨酸降解能力的菌种的简并引物，本发明的另一目的在于还提供利用该简并引物筛选瓜氨酸降解菌的方法。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的一种用于快速筛选瓜氨酸降解菌的简并引物，

其序列为：

PTP1-F:5’-NACHACHGGCCAHACRAA-3’

PTP2-R:5’-GTHGAYATHATGGTMTTYAT-3’