[发明专利]一种活性小分子肽及其制备方法、应用

权利要求书

1.一种活性小分子肽，其特征在于，

所述活性小分子肽为五肽，氨基酸序列：TLFGL。

2.一种活性小分子肽制备方法，其特征在于，

包括以下步骤：

S0：固定化ACE凝胶亲和吸附柱的制备；

S01：将ACE溶解于硼酸盐缓冲液制得ACE螯合配体溶液；

S02：往溴化氰活化琼脂糖凝胶4B中加入稀盐酸进行溶胀，过滤后用硼酸盐缓冲液清洗、滤干，除去残余HCl，得溴化氰活化琼脂糖4B填料；

S03：将ACE螯合配体溶液与溴化氰活化琼脂糖4B填料混合，搅拌均匀后螯合过夜，螯合后，用4-6倍溴化氰活化琼脂糖4B填料体积的硼酸盐缓冲液进行清洗和过滤，除去多余的ACE；

S04：将滤干后的溴化氰活化琼脂糖4B填料与Tris-HCl缓冲液混匀，进行轻柔振荡后过滤；

S05：过滤后，采用醋酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液交替清洗过滤3-5次，得ACE固定化凝胶填料，将ACE固定化凝胶填料悬浮于硼酸盐缓冲液，装填入层析柱，即为固定化ACE凝胶亲和吸附柱；

ACE的酶活力单位为4.5-5.5U/ml；

硼酸盐缓冲液的pH为8.1-8.4，摩尔浓度为0.08-0.12M，除步骤S05的硼酸盐缓冲液外，其余步骤的硼酸盐缓冲液均含有0.45-0.55M的NaCl；

溴化氰活化琼脂糖凝胶4B与稀盐酸的质量体积比为0.8-1.2g：5mL，稀盐酸的摩尔浓度为0.9-1.1mM；

螯合过夜的温度条件为0-4℃；

Tris-HCl缓冲液的pH为7.9-8.1，摩尔浓度为0.08-0.12M，除步骤S05的硼酸盐缓冲液外，其余步骤的硼酸盐缓冲液均含有0.45-0.55M的NaCl；

轻柔振荡的振荡温度为23-27℃，振荡时间为1.8-2.2h；

醋酸盐缓冲液的pH为3.8-4.2，摩尔浓度为0.08-0.12M，含有0.45-0.55M的NaCl；

S1：肽组分的制备，取河鲀鲜鱼皮，绞碎后加入水，匀浆形成鱼皮浆料液，加入蛋白酶进行酶解，酶解后进行灭酶处理，冷却后调节pH值至中性，得酶解液，对酶解液进行微滤，然后进行超滤处理，获得分子量小于1kDa的肽组分；采用酶活力单位为5万U/g的碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件为碱性蛋白酶添加量为鱼皮浆料液质量的0.8-1.2％，pH值为7.8-8.2，酶解温度为58-62℃，酶解时间为5.8-6.2h；

绞碎后加入的水为蒸馏水，河鲀鲜鱼皮与蒸馏水的质量体积比为0.9-1.1kg:10L；

采用转速为11000-13000rpm/min的组织匀浆器进行匀浆；

酶解后通过煮沸加热9-11min进行灭酶处理，采用HCl调节pH值至中性；

微滤采用Φ30mm×800mm的陶瓷膜元件，过滤精度为200nm，膜通量为600-1000L/M²H，超滤采用截留分子量为1kDa的聚醚砜超滤膜；

S2：肽组分的亲和吸附和洗脱，将所述步骤S1获得的分子量小于1kDa的肽组分用所述步骤S0制得的固定化ACE凝胶亲和吸附柱进行亲和吸附和洗脱，并进行紫外检测，紫外检测波长为220nm，收集洗脱峰组分，对洗脱峰组分进行脱盐，减压浓缩后待用；

S21：在中压蛋白纯化仪上，安装好所述步骤S0制得的固定化ACE凝胶亲和吸附柱，用摩尔浓度为0.08-0.12M、pH为7.9-8.1的硼酸盐缓冲液进行平衡18-22min，平衡流速0.45-0.55mL/min，并在紫外检测仪检测，紫外检测波长为220nm；

S22：平衡后进行所述步骤S1获得的分子量小于1kDa的肽组分的上样吸附，上样量4.5-5.5mL，流动相用摩尔浓度为0.08-0.12M、pH为7.9-8.1的硼酸盐缓冲液，流速0.45-0.55mL/min，观察至检测基线平稳后14-16min，以摩尔浓度为0.08-0.12M、pH为7.9-8.1的硼酸盐缓冲液为洗脱流动相进行洗脱，且硼酸盐缓冲液含有0.8-1.2M的NaCl，洗脱流速0.45-0.55mL/min，收集洗脱峰组分；

S23:固定化ACE凝胶亲和吸附柱用摩尔浓度为0.08-0.12M、pH为7.9-8.1的硼酸盐缓冲液重新进行平衡18-22min后，按步骤S22进行多次的肽组分上样和洗脱，将多次洗脱峰组分合并，采用截留分子量为100D的透析袋对洗脱峰组分进行脱盐，减压浓缩后待用；

S3：肽的序列鉴定，对步骤S2减压浓缩后的洗脱峰组分进行质谱测定，对质谱测定的结果进行分析，得到其中一条活性小分子肽的氨基酸序列为TLFGL；

采用LC-MS/MS进行质谱测定，测定条件为：色谱柱为PepMap RPLC C₁₈,75μm i.d.×150mm,3μm，阳离子模式，扫描范围：m/z 300-1500Da，发射极喷雾电压2-kV，质谱测定的结果用PEAKS STUDIO软件进行分析，获得高可信活性小分子肽氨基酸序列；

S4：将活性小分子肽TLFGL按步骤S3测定的氨基酸序列进行固相合成，验证合成活性小分子肽的ACE抑制活性。

3.根据权利要求1所述的活性小分子肽在制备降血压药物或二肽基肽酶Ⅳ抑制剂中的应用。