[发明专利]一种油茶叶肉原生质体分离与纯化方法

说明书

本发明公开了一种油茶叶肉原生质体分离与纯化方法，属于植物生物技术领域。本发明方法包括以下步骤：对油茶组培苗进行22～32h黑暗预处理，采集组培苗完全展开的叶片；去掉采集叶片的主脉和叶缘，切成叶条加入到含EME培养基的无菌瓶中，盖上封瓶膜，负压下抽真空10min～1h；吸出EME培养基、加入酶液；无菌瓶用封口膜封口后酶解6～14h；将酶解后的溶液通过无菌筛过滤，滤液离心后去上清，用W缓冲液对原生质体进行清洗和重悬，冰上静置沉淀后，吸去上清，得到纯净的原生质体。通过本发明方法获得的原生质体形态完整、稳定，产量高达2.8×10⁷个/g·FW，原生质体活力高达91.7％以上。

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，涉及原生质体的分离与纯化，更具体的涉及一种油茶叶肉原生质体分离与纯化方法。

背景技术

油茶广泛分布于我国南方多省，是我国重要的木本油料树种，无论种植面积还是产量均居木本食用油料首位。在维护我国粮油安全、精准扶贫和美丽乡村建设中发挥了重要作用。茶油中油酸和亚油酸含量达80％以上，风味独特，营养丰富，耐贮藏，易被人体吸收，是优质食用油之一，故被誉为“东方橄榄油”。茶油的价值不仅体现在食用方面，还体现在医疗、保健和美容，具有消炎、降血脂、软化血管、抗氧化以及抗癌等多种功能。

目前油茶品种繁多，但高产、抗逆性强的品种仍然十分有限。由于油茶童期长且基因高度杂合，常规育种如选择育种与杂交育种效率低，亟需更加高效的育种途径，加快油茶育种进程。由于原生质体具有全能性，通过酶解法得到的原生质体进行培养，有获得再生植株的潜能。原生质体融合(体细胞杂交)技术也在不断发展，通过原生质体融合再生的杂交植株，有助于突破有性杂交障碍，进行远缘杂交实现胞质基因组的重组交换，染色体加倍，获得异源多倍体。因此，开展油茶原生质体分离和细胞融合研究，在油茶的品种改良上具有广阔的应用前景。

在木本植物中，原生质体分离技术起步比较晚，柑橘原生质体分离体系最先建立。目前，体细胞融合技术，在柑橘上已获得几百个体细胞杂种，有些已应用于新品种选育、三倍体育种、砧木选育等方面；在杨树、苹果、枣、杉木等木本植物上也取得了不错进展。

油茶原生质体分离技术也已有报道，专利申请CN111705033A“一种油茶愈伤悬浮培养及原生质体分离的方法”，公开了一种油茶愈伤组织悬浮培养及原生质体的制备和纯化方法，原生质体数量可达1.17×10⁷个/g·FW，为了后期进行不同源原生质体融合和培养的研究，需要建立悬浮系之外的原生质体分离体系。机械法进行油茶叶肉原生质体的制备已有报道，通过机械法制备的原生质体不会受酶等化学试剂的伤害，所需费用低，原生质体产量达到5.1×10⁵个/g·FW，相对较低。相比机械法而言，酶解法操作简单，获得的原生质体产量多，目前植物原生质体分离、细胞融合等研究大多数均采用酶解法制备原生质体。而采用酶解法制备油茶叶肉原生质体的研究目前尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术存在的问题，提供一种油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，包括以下步骤：

(1)对油茶组培苗进行22～32h黑暗预处理，采集油茶组培苗完全展开的叶片。该步骤中，油茶组培苗黑暗预处理的时间优选为24h。

(2)去掉步骤(1)采集的叶片的主脉和叶缘，切成叶条加入到含EME培养基的无菌瓶中，盖上封瓶膜，负压下抽真空10min～1h。然后吸出EME培养基、加入酶液。无菌瓶用封口膜封口后酶解6～14h。