[发明专利]一种基于熔解曲线的多重数字核酸分析装置和分析方法

权利要求书

1.一种基于熔解曲线的多重数字核酸分析装置，其特征在于，包括微流控芯片、平板PCR仪、荧光检测系统和处理器；所述荧光检测系统包括激发光源、滤光片及相机。

2.如权利要求1所述的多重数字核酸分析装置，其特征在于，所述微流控芯片包括滑动式微流控芯片，所述滑动式微流控芯片包括下芯片和上芯片，所述下芯片和上芯片为两块紧密接触的平板，两块所述平板间具有一层润滑油；所述下芯片和所述上芯片上分别加工有管路和孔。

3.如权利要求1所述的多重数字核酸分析装置，其特征在于，所述平板PCR仪和所述荧光检测系统集成为同一个系统。

4.一种基于熔解曲线的多重数字核酸分析方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1、在微流控芯片上将PCR反应体系分散到大量反应微单元中，得到分散后的反应微单元，所述微反应单元的体积可以是同等大小也可以是不同大小；

步骤2、将经过步骤1分散后的微流控芯片放在平板PCR仪上，对其进行数字PCR扩增，在步骤1获得的每个独立的分散后的微反应单元中对核酸进行扩增，得到扩增产物；

步骤3、数字熔解曲线分析，对步骤2进行扩增的微反应单元进行温度控制和荧光检测，获得所述微反应单元的熔解曲线，并分析所述熔解曲线；最后根据阳性微反应单元在总微反应单元的比例、微反应单元的体积以及扩增反应效率因素，对目标核酸进行准确的定量分析。

5.如权利要求3所述的多重数字核酸分析方法，其特征在于，所述步骤1还包括分散所述PCR反应体系的方法包括微液滴、微孔或微腔室法，通过流体控制设备，根据表面物理及化学性质、离心力、表面张力、重力或剪切力多种驱动力完成；所述PCR反应体中包括核酸嵌入式荧光染料，所述核酸嵌入式荧光染料包括SybrGreen、EvaGreen或PicoGreen。

6.如权利要求3所述的多重数字核酸分析方法，其特征在于，所述步骤2还包括：所述数字PCR扩增反应可以是需要热循环的PCR核酸扩增，也可以是等温核酸扩增(isothermalamplification)的方法。

7.如权利要求3所述的多重数字核酸分析方法，其特征在于，所述步骤3中获得所述数字熔解曲线的方法为：

设置一个步进的温度梯度，从低于双链核酸解旋的温度逐渐升温到所述双链核酸解旋的温度，每度采集荧光图片，得到一系列随温度变化的荧光图片；通过监控所述芯片上每个微孔随时间变化的荧光值的变化，并将其拟合成一条光滑的曲线，可以得到所述每个微孔的所述扩增产物的所述熔解曲线；对其求一阶导数，可以得到所述熔解曲线的峰值(Tm)图。

8.如权利要求6所述的多重数字核酸分析方法，其特征在于，所述温度梯度包括小于0.25摄氏度的阶梯；所述低于双链核酸解旋的温度包括65℃；所述双链核酸解旋的温度包括95℃。

9.如权利要求3所述的多重数字核酸分析方法，其特征在于，所述步骤3还包括：.通过扩增产物或扩增引物的设计，使不同的目标核酸的扩增产物具有不同的特征熔解曲线或熔解温度；并采用熔解曲线模拟软件(uMELT)预测扩增子的所述熔解温度；在实时荧光定量PCR仪上验证所述熔解温度。

10.如权利要求3所述的多重数字核酸分析方法，其特征在于，所述步骤3中的定量分析的方法包括泊松分布法。