[发明专利]基于细菌生物被膜的肿瘤治疗工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提出基于细菌生物被膜的肿瘤治疗工程菌及其构建方法和应用，该肿瘤治疗工程菌通过基因工程手段构建光信号操控细菌生物被膜形成及裂解的基因回路，通过光敏蛋白在近红外光的调控下合成信使分子，信使分子一方面调控细菌生物被膜的形成，另一方面调控抗终止蛋白的表达，抗终止蛋白调控裂解蛋白的表达，从而可以通过程序性的控制光信号的辐射强度从而精确操控肿瘤组织内细菌表型，实现组织内细菌生物被膜形成及裂解的周期性变化，实现治疗菌株在肿瘤组织内的长时间有效定植，避免重复给药的同时达到药物释放浓度和位置的精确控制。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及基于细菌生物被膜的肿瘤治疗工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

癌症已成为威胁人类生命健康最主要的疾病之一，传统的治疗方法，包括放疗、化疗、手术及靶向性药物等，存在靶向不完全、组织穿透性不足或细胞毒性等缺陷从而阻碍治疗效果，导致复发率和死亡率的增加。

研究表明，多种细菌具有较强的侵入和在实体肿瘤内定植的能力，同时还能产生毒素，从而抑制肿瘤的生长。沙门氏菌已被证明在肿瘤中会优先富集，它们在肿瘤组织内的定植浓度是正常组织的1000倍，同时它们还能产生各种毒素，破坏细胞信号，从而抑制肿瘤的生长。铜绿假单胞菌产生的S2对肿瘤细胞HepG2有明显的细胞毒性作用，而对正常细胞无影响。肿瘤靶向细菌除了具有直接的抗癌作用外，还可以修饰为药物载体，产生直接杀伤细胞的蛋白，通过信号通路诱导细胞凋亡，刺激免疫系统产生抗肿瘤作用。例如，沙门氏菌株(减毒，营养不良菌种)已被用作肿瘤内各种细胞因子表达的载体，导致肿瘤生长迟缓，在某些情况下，可以完全清除肿瘤。

虽然肿瘤细菌治疗已经有100多年的历史，但是治疗效果不稳定，其主要局限性是如何保证细菌将治疗药物有效地释放到肿瘤微环境中。现有的细菌疗法中一般利用肿瘤微环境、外部信号分子等激活目的基因的转录。Hasty等人设计了一种临床的治疗菌株，基于群体感应反馈回路同步裂解，并通过与人类癌细胞在体外共培养展示了其作为药物输送载体的巨大潜力。除了环境传感器，细胞外诱导剂通常被用于精确触发基因表达。在小鼠模型中，静脉注射阿拉伯糖可以激活定植肿瘤中细菌的基因表达。目前没有技术能够实现人为操控肿瘤内细菌的表型，究其原因是在肿瘤细菌疗法中无法精确操控肿瘤内细菌基因线路中特定基因的表达。

现有的肿瘤细菌疗法中多数是将细菌作为一个独立的载体用于激活人体的免疫系统、释放细菌毒素以及抗癌药物等达到肿瘤治疗的目的。利用肿瘤内微环境的不同靶向释放药物的方法存在易脱靶、特异性差、组织穿透力弱、药物浓度不受控以及易受免疫系统干扰等缺陷。因此，需要多次注菌才能达到较好的治疗效果，这也增加了细菌治疗的毒性。

另外，相比于浮游细菌，形成生物被膜的细菌可以抵抗人体免疫系统的清除、加剧肿瘤内出血、抑制癌细胞的转移。例如：在SOS反应过程中，癌细胞内细菌生物被膜的形成导致癌细胞转移中断；链球菌生物被膜中释放的多糖可以抑制癌细胞对内皮细胞的粘附，这是癌细胞转移的必要步骤。但是目前并没有方法可以操控肿瘤组织内细菌生物被膜的形成，也没有实验证实生物被膜的形成在肿瘤治疗中的重要作用。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种基于细菌生物被膜的肿瘤治疗工程菌，使得该工程菌在肿瘤治疗中可以人为操控其在肿瘤内的表型，提高肿瘤细菌治疗的靶向性和特异性，并且实现长时间有效定植，避免重复给药，降低毒性。

为实现上述目的，本发明提出一种基于细菌生物被膜的肿瘤治疗工程菌，所述肿瘤治疗工程菌具有三种状态，依次包括：能够分裂生长，但无法粘附在细胞表面的状态；形成生物被膜的状态；以及裂解的状态。

优选地，所述肿瘤治疗工程菌具有响应外界环境刺激的响应蛋白，以诱导合成c-di-GMP信使分子，所述c-di-GMP信使分子操控所述肿瘤治疗工程菌形成生物被膜或裂解；

优选地，所述外界环境包括pH、温度、压力、渗透压、氧气、光、电磁波、化学信号分子中的任一种。