[发明专利]pSFV-p32病毒样颗粒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种pSFV-p32病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括：

(1)构建得到pSFV-sp6-p32质粒；

(2)将pSFV-sp6-p32、SFV-helper质粒体外转录成mRNA，然后将pSFV-sp6-p32、SFV-helper质粒体外转录的mRNA共电转入BHK细胞中，得到pSFV-p32病毒样颗粒；

其中，所述pSFV-sp6-p32质粒是通过采用塞姆利基森林病毒为载体，并合成如SEQ IDNO.1所示的ASFV p32基因，然后将所述ASFV p32基因插入所述载体而得。

2.如权利要求1所述的pSFV-p32病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括：

(1.1)合成ASFV p32基因，所述ASFV p32基因的序列为SEQ ID NO.1；

(1.2)设计引物tongyong-F，SP6-p32-R并合成，所述引物tongyong-F的序列为SEQ IDNO.2，所述引物SP6-p32-R的序列为SEQ ID NO.3；

(1.3)用BamHI/SmaI酶切双酶切质粒pSFV-sp6-EGFP；

(1.4)将基因合成所述ASFV p32基因片段和步骤(1.3)酶切的载体片段同源重组，得到重组产物；

(1.5)将所述重组产物加入到感受态细胞DH5α细胞，进行重组产物转化；

(1.6)将转化后的重组产物进行重组产物鉴定；

(1.7)将鉴定后的重组产物提取质粒；

(1.8)对所述质粒进行酶切鉴定及测序。

3.如权利要求2所述的pSFV-p32病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1.3)中，所述pSFV-sp6-EGFP由下述方法制得：

设计与合成引物，所述引物包括设计引物Cs-EGFP-F和Cs-EGFP-R，以及菌液鉴定引物EGFP-鉴定-F和EGFP-鉴定-R：

以EGFP-C1为模板，以Cs-EGFP-F，Cs-EGFP-R为引物扩增Cs-EGFP片段，然后经过酶切、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，构建得到复制子质粒pSFVCs-sp6-EGFP；

以pSFVCs-sp6-EGFP为模板，以EGFP-F，EGFP-R为引物扩增片段，然后经过酶切、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，构建得到复制子质粒pSFV-sp6-EGFP。

4.如权利要求2所述的pSFV-p32病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1.6)中，将转化后的重组产物进行重组产物鉴定包括：

将转化后的重组产物过夜培养并挑选菌落进行菌液鉴定；

所述菌液鉴定的PCR体系包括菌液、设计引物tongyong-F，设计引物SP6-p32-R。

5.如权利要求1所述的pSFV-p32病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括：

(2.1)线性化pSFV-sp6-p32和SFV-helper；

(2.2)将线性化后的pSFV-sp6-p32和SFV-helper进行体外转录；

(2.3)将pSFV-sp6-p32及SFV-heleper体外转录的mRNA共电转入BHK细胞中，得到pSFV-p32病毒样颗粒。

6.如权利要求1或5所述的pSFV-p32病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述SFV-helper质粒是通过构建如SEQ ID NO.4所示的重组载体，并合成如SEQ ID NO.5所示的插入片段基因，然后将所述插入片段基因克隆入所述重组载体而得。