[发明专利]一种基于液相色谱-质谱联用的大规模血浆脂质靶向定量分析方法

说明书

本发明采用内标校正的外标准曲线来进进行脂质的浓度定量分析，既解决单纯峰面积相对定量方法中无法校正实验过程前处理及质谱分析的偏差、不能准确反映实际脂质浓度变化关系的不足之处，同时也解决了单一内标或多个内标这种内标法定量过程无法解决实际脂质在质谱仪器上的非线性信号变化；且采用甲基叔丁基醚‑甲醇提取液提取、异丙醇:乙腈＝1:1复溶的方式进行前处理，操作简单快速，溶剂毒性小，可适用于大规模的样本分析。

技术领域

本发明涉及分析化学和生物检测，是一种基于液相色谱-质谱联用的大规模血浆脂质定量分析方法。

背景技术

脂质是一类非溶性的小分子物质，主要分为脂肪酸、甘油脂、磷脂或胆固醇。脂质广泛分布于人细胞及血液中，脂质是细胞膜的组成成分，并在机体的能量储存、信号分子等方面起着重要作用。在人血液中，脂质在所有物质中占比超过65％，是血液重要的组成成分，由于血液采集方便，是脂质研究中最常见的样本来源。目前人血液的脂质分析在癌症研究的标志物筛选、机体代谢机及临床诊断方面是研究的热点。

当前脂质分析主要依赖于液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术，常用的定性定量方法有借助三重四级杆(QQQ)低分辨的广泛靶向分析技术(拟靶向)及借助高分辨质谱的非靶向技术。定量方法主要是利用各物质峰面积进行分析的相对定量及利用内标校正法进行脂质浓度计算的绝对定量方法。对于相对定量由于无法校正实验过程前处理及质谱分析的偏差，定量结果不准确。同样内标校正法进行脂质浓度计算的绝对定量方法无法解决实际检测过程中脂质在质谱仪器上的非线性信号变化及定量结果准确性问题。因此，开发一种新的脂质靶向定量分析方法具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术不足，提供一种基于液相色谱-质谱联用的液相色谱-质谱联用的大规模血浆脂质定量分析方法。所述的方法包括如下步骤

第一步：样品准备：将低温保存的样本解冻，取适量样本加入到离心管中；

第二步：加入内标混合溶液，其中所述的内标混合溶液含有至少20种，优选21种、更优选22种，更优选23种、最优选24种同位素内标；

第三步：加入脂质提取液；

第四步：加入双蒸水、振荡、静置；

第五步：4℃条件下高速转速离心，取上清，冷冻干燥；

第六步：将步骤五获得的干燥样品用复溶液复溶，4℃条件下高速离心，再用LC-MS分析用复溶液复溶，涡旋后4℃条件下高速离心，取上清装入上样瓶；

第七步：配制10-15种不同浓度的脂质标准品溶液，标准品溶液中加固定量的内标母液，使其最终浓度与第六步中复溶后的提取液中内标浓度一致；

第八步：超高效液相色谱-质谱检测；

第九步：数据分析。

在一个具体的实施例中，所述的高效液相色谱检测使用的仪器为ExionLC ADUPLC–Triple Quad^TM 6500⁺(SCIEX,USA)；所述的液相色谱的条件为：色谱柱Accucore^TMC30column，流动相A(A相)：甲醇/乙腈/水＝30:30:40，且含有10mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸、5μmol/L亚甲基二磷酸；流动相B(B相)：异丙醇和乙腈按照90:10的体积比的混合液，且含有10mmol/L甲酸铵、0.1％甲酸、5μmol/L亚甲基二磷酸。流速为0.4mL/min；自动进样器温度为10℃。色谱柱温40℃。

在另外一个具体的实施例中，所述的超高效液相色谱的进样及洗脱条件为正模式下进样体积为2μL，负模式下进样体积为4μL。梯度洗脱程序如下表：