[发明专利]一种实时荧光监测冷冻聚焦离子束加工装置及方法

说明书

本发明涉及一种实时荧光监测冷冻聚焦离子束加工装置及方法，包括真空腔室、离子束系统和荧光成像系统。其中，真空腔室内设置有冷台，用于放置冷冻样品，冷冻样品内设有荧光标记物。离子束系统设于真空腔室上，指向冷冻样品设置，用于对冷冻样品进行离子束加工。荧光成像系统设于真空腔室上，位于冷冻样品的下方，用于对冷冻样品进行实时光学成像。加工时，通过荧光成像系统对冷冻样品发射激发光，激发样品中的荧光标记物发射荧光，荧光被荧光成像系统接收形成冷冻样品中目标结构的图像。通过对荧光图像和信号的监测分析，实时监控冷冻样品的加工过程，实现了冷冻样品的原位实时监测加工，无需转移，提高了目标结构的加工准确度，缩短了加工时间。

技术领域

本发明涉及显微成像的技术领域，尤其涉及一种实时荧光监测冷冻聚焦离子束加工装置及方法。

背景技术

冷冻电镜技术通过快速冷冻或高压冷冻技术把生物样品冷冻在近生理状态，保存高分辨结构。而电子断层成像技术是冷冻电镜的重要技术手段。通过对冷冻样品的系列倾转成像，进行三维重构，得到生物样品超微结构的高分辨三维结构。由于透射样品只能观察几十至几百纳米厚的样品。对于几微米甚至更厚的细胞组织样品，无法直接观察，需要进行切片。对冷冻的生物样品切片的技术主要有两类：一类是使用冷冻超薄切片机对样品进行切片。使用钻石刀可以切到约100nm厚的切片。但该技术难度大，不易普及，且切片产生皱褶形变，冰晶污染等问题，而且成功率很低。另一种技术是使用冷冻聚焦离子束技术。利用聚焦到几纳米的高能离子束对样品进行加工，可以得到非常平整的200nm左右的生物薄片样品。该技术成为目前非常重要的技术手段。

对于冷冻聚焦离子束技术的操作中，对冷冻样品精确的定位切割加工是非常重要的技术环节，冷冻双束扫描电镜是样品加工设备，由于需要观察的细胞结构通常在细胞内部，利用冷冻双束扫描电镜从表面无法观察。通常提前对需要观察的细胞结构进行荧光标记，通过荧光成像进行预定位，通过定位的指导，再进行冷冻聚焦离子束加工，这样才能切到准确的位置。目前荧光成像定位通常有两种方式：一种方式，荧光成像装置和冷冻聚焦离子束装置是两台独立设备，把预先做好荧光标记的冷冻生物样品转移至荧光成像装置成像，再把样品转移至冷冻聚焦离子束装置，把荧光图像和扫描电镜图像精确对齐后，可以找到并定位需要的结构，进行加工；第二种方式是把两种设备集成在一起，在冷冻双束扫描电镜腔室内，集成一个荧光显微镜，荧光显微镜和离子束系统并排或样品同侧放置，冷冻样品通过样品台的移动，先移动到荧光显微镜的位置实现荧光成像，再移动至离子束系统的位置，进行离子束切割加工，先粗切割，然后再转移至荧光显微镜位置，再次观察荧光信号是否在，再回到离子束位置切割，如此反复，直到切成一个200nm左右甚至更薄的薄片。

然而，目前的上述两种方法各有优缺点，第一种方式，由于荧光显微镜和冷冻双束扫描电镜设备分离，可以分别成像，通量高，但由于一次对齐，精度相对较差，成功率低。第二种方式，由于通过荧光原位成像，可以反复监测荧光信号的位置，成功率大大提高，但整个加工过程中，由于荧光成像和离子束加工不能同时进行，需要把样品来回移动或倾转，每次需要重新定位，实验时间长，效率低，不利于高通量样品制备，定位精度也有限，不能满足高准确性的离子束加工需求。

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种实时荧光监测冷冻聚焦离子束加工装置及方法，解决了现有技术中冷冻样品离子束加工时加工过程长、加工效率低，定位精度差，且成功率低的问题。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明提供了实时荧光监测冷冻聚焦离子束加工装置及方法，具体技术方案如下：

一种实时荧光监测冷冻聚焦离子束加工装置，包括：

真空腔室，内部设置有冷台，用于存放冷冻样品，冷冻样品内设有荧光标记物；

离子束系统，设于真空腔室上，并指向冷冻样品设置，用于对冷冻样品进行离子束加工；