[发明专利]用于对虾肝肠孢虫荧光定量PCR检测的引物及方法

权利要求书

1.一种用于快速检测对虾肝肠孢虫的荧光定量PCR法的特异性引物，其特征在于，该引物包含引物EHP146F和引物EHP146R，

所述的引物EHP146F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的引物EHP146R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

其扩增序列146bp。

2.一种用于检测对虾肝肠孢虫SWP基因的标准品试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含SWP标准质粒以及权利要求1所述的特异性引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，阴性质控品为含pMD19T空质粒的克隆菌株菌悬液，阳性质控品为SWP克隆菌株的菌悬液。

4.一种检测对虾肝肠孢虫的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述方法采用权利要求2或3所述的标准品试剂盒，所述方法包括以下步骤：

步骤1：样本的采集及提取，幼体、仔虾及小于2cm的幼虾取完整个体，大于2cm的幼虾、亚成年虾及成虾取肝胰腺；样品采集10～50mg，采用QiagenDNAMiniKit试剂盒提取样品总DNA；

步骤2：将提取的待检样品和标准质粒置于荧光定量PCR反应体系中进行PCR扩增及荧光信号监测；所述PCR反应体系包括所述引物及Takara TB Green Premix Ex TaqTM II试剂；同时设置阳性质控品、阴性质控品对照和无模板对照；

步骤3：根据标准质粒扩增的Cq值，绘制标准曲线；

步骤4：根据标准曲线及待检样品扩增的Cq值，计算目标样品所含EHP拷贝数；其中：样品Cq35且有明显S型扩增曲线，结果为阳性，并可根据Cq值和标准曲线计算拷贝数；样本Cq本准曲且无明显S型扩增曲线，结果为阴性；阳性质控品Cq值35且有明显S型扩增曲线，同时阴性质控品和无模板对照Cq模板对且无明显S型扩增曲线，判断结果有效。阳性质控品Cq值≥35或阴性质控品和无模板对照Cq值35，判断结果无效。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应体系总体积为25ul，包括TB Green Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus)(2*)12.5ul，所述的引物EHP146F和引物EHP146R各1.25ul，待检样品DNA或标准质粒1ul，灭菌水9ul。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增反应程序为95℃30s；40个循环，95℃5s，51℃30s。