[发明专利]一种构建重组解脂耶氏酵母的方法与应用

说明书

本发明公开了一种提高解脂耶氏酵母温度耐受性或提高高温条件下解脂耶氏酵母的赤藓糖醇产量的方法，包括如下步骤：将高温耐受性基因在受体解脂耶氏酵母中过表达，得到对高温耐受性或赤藓糖醇产量高于所述受体解脂耶氏酵母的目的解脂耶氏酵母。本发明通过NCBI、PDB等数据库对酿酒酵母和嗜热微生物耐热基因信息进行挖掘整理，将不同功能的基因作为候选元件，密码子优化后构建质粒表达载体，转化到解脂耶氏酵母工业菌株中，筛选重组子表达菌株，通过发酵评价，获得可以在35℃条件下提高其赤藓糖醇产量的不同功能的耐热基因Yap1、Hsp12、Vma2、Hul5、Tsa1和Groes。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一种构建重组解脂耶氏酵母的方法与应用。

背景技术

赤藓糖醇(1,2,3,4-丁四醇)是一种四碳功能糖醇，广泛分布于水果，发酵食品和动物中。由于其在机体内的代谢能量较低，可防治牙齿龋变，以及低胰岛素代谢响应等，是低热量甜味剂，因此被广泛应用于食品、医药和化工等领域。赤藓糖醇的市场发展空间巨大，应用前景十分广阔。尽管水果、海带等食物中广泛含有赤藓糖醇，但利用嗜高渗或耐高渗酵母生物发酵生产赤藓糖醇是主要的生产方式。目前，解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)已经实现了规模化赤藓糖醇发酵生产，取得了较好的经济效益。但利用该菌株生产赤藓糖醇的发酵温度一般是30℃，这样的发酵温度在夏天等温度较高的季节生产时需要进行循环冷却处理，从而增加生产成本，甚至导致工厂停产，严重影响企业的生产经营和经济效益。因此，提高解脂耶氏酵母的温度耐受性，增加生产周期，提高经济效益迫在眉睫。

传统的诱变耗时耗力，菌株遗传稳定性差，且通常以降低产物产量为代价，因此不适合构建工业微生物菌种。随着酿酒酵母在高温胁迫下应答和防御机制的阐明及嗜热菌来源耐热元件的表征，为理性育种耐高温酵母提供了新靶点。例如，研究者发现泛素连接酶Rsp5和泛素结合酶的过表达导致在较高的温度(39℃)下改善多重胁迫耐受性；热应激还会引起ROS损伤，而通过敲除糖基磷脂酰肌醇固定的膜蛋白编码基因DFG5可以提高酵母的耐热性。Liu等通过引入来自腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobactertengcongensis)的耐热元件，使酿酒酵母在42℃条件下的细胞活力明显高于对照菌株。Zhou等通过异源表达来自凝结芽孢杆菌(Baciluscoagulans)2-6的冷激蛋白cspL，大大增强了大肠杆菌和酿酒酵母(在36℃时生物量增加了2.6倍)的高温生长。Wang等通过在解脂耶氏酵母中单独过表达Rsp5基因使其在33℃条件下保持高产赤藓糖醇的特性。

解脂耶氏酵母细胞在高温胁迫下，细胞内的功能蛋白可能会发生热变性、错误折叠及聚集等；细胞内的pH稳态可能会失衡；细胞内结构可能会受到氧化损伤；核酸可能会降解或突变。因此，针对高温胁迫对其造成的影响，挖掘具有相应保护功能的元件，对提高解脂耶氏酵母在高温下高产赤藓糖醇的能力具有非常重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高解脂耶氏酵母温度耐受性，如何提高高温条件下解脂耶氏酵母的赤藓糖醇产量。

为了解决以上技术问题，本发明的第一个目的是提供了构建重组解脂耶氏酵母的方法，包括将高温耐受性基因导入解脂耶氏酵母，得到所述重组解脂耶氏酵母；所述高温耐受性基因下述基因中的至少一种：Groes基因、Hsp12基因、Tsa1基因、Hul5基因、Vma2基因和Yap1基因；

所述Groes基因编码如下A1)-A3)中任一种蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中序列12的蛋白质，

A2)将A1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有高温耐受性活性的蛋白质，

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；

所述Hsp12基因编码如下B1)-B3)中任一种蛋白质：