[发明专利]复方番茄干细胞分离培养提取与口服液制作方法及工艺

权利要求书

1.复方番茄干细胞分离培养提取与口服液制作方法及工艺，其特征在于：它包括以下制备步骤：

步骤1：离体材料的制备

优选无化肥农药污染、纯农家肥栽培的番茄，外皮已呈红色，内心尚未熟透，表皮无划伤的番茄果实，用水冲洗表面附着物，放进120mg/L的L-抗坏血酸液中浸泡1分钟，然后再放进1％升的苯菌灵溶液中杀菌10分钟，用无菌水冲洗10分钟，再放入75％的乙醇液中杀菌1分钟，用无菌水冲洗再放入30％升的过氧化氢液中杀菌10分钟，然后再用无菌水冲洗10分钟；

步骤2：优选固态培养基的制备

先准备硝酸钾2480-2500mg/L，硫酸镁120-122mg/L，硫酸锰10-11mg/L，硫酸锌1.8-3mg/L，硫酸铜0.02-0.06mg/L，硫酸胺130-140mg/L，氯化钙112-114mg/L，碘化钾0.6-0.75mg/L，氯化钴0.023-0.025mg/L，磷酸二氢钠130-135mg/L，硼酸2.6-3mg/L，钼酸钠0.2-0.25mg/L，乙二胺四乙酸铁钠盐35-37mg/L，肌醇200-230mg/L，硫胺素18-21mg/L，烟酸1.8-2.1mg/L，吡哆醇1.8-2.1mg/L，L-抗坏血酸50-55mg/L，柠檬酸70-80mg/L，L-天冬氨酸130-140mg/L，L-精氨酸170-180mg/L，甘氨酸75-85mg/L，脯氨酸115-125mg/L，a-萘乙酸1.5-3.0mg/L，蔗糖或果糖10.000mg/L，活性炭400-500mg/L，琼脂3.600-3.800mg/L，磁化水0.7升，备用，然后将无机盐各养分分别用20m1磁化水稀释，将维生素类合并放入50m1无菌水中稀释，将氨基酸全部放入50m1无菌水中稀释，将生长素放入10ml无菌水中稀释，接着将无机盐类各分别注入烧瓶中0.7升磁化水中，边加入边搅拌，再将蔗糖、固化剂、活性炭放入、进入高压灭菌30分钟，降温后取出，再将维生素溶液、氨基酸溶液、生长素溶液分别放入搅匀后，冷凝；

步骤3：离体材料诱导及形成层分离培养

先将灭菌的番茄果实用接种刀切成八段，将最外层薄皮去掉，去掉内心，将外皮的内皮层取出放进固态培养基中，在受控暗室内培养26天，培养温度25℃，然后将形成层细胞系用接种铲轻轻将其移入另一同样培养基烧瓶内，进行放大培养，接着将其放大培养的细胞系群体移入液态培养基中，在暗室内用摇床旋转培养，在160rpm、25℃环境中培养，传代时间设定为20天；

步骤4：优选液态培养基的制备

先准备硫酸钾990-995mg/L，磷酸氢钾160-170mg/L，硫酸镁180-185mg/L，硫酸锰20-25mg/L，硫酸锌8-10mg/L，硫酸铜0.2-0.3mg/L，氯化钙70-75mg/L，硝酸钙460-490mg/L，钼酸钠0.2-0.4mg/L，硼酸6-8mg/L，硝酸胺400-420mg/L，乙二胺四乙酸铁钠盐35-38mg/L，肌醇195-230mg/L，硫胺素21-22mg/L，烟酸2-4mg/L，吡哆醇2-4mg/L，L-抗坏血酸55-65mg/L，柠檬酸72-82mg/L，L-天冬氨酸132-142mg/L，L-精氨酸172-182mg/L，甘氨酸76-86mg/L，脯氨酸115-125mg/L，a-萘乙酸2-3mg/L，蔗糖31.000mg-32.000mg/L，麦饭石颗粒60.000mg/L，锗石颗粒60.000mg/L，硒矿石颗粒90.000mg/L，磁化水0.7升，备用，然后将无机盐各养分分别用20m1磁化水稀释，将维生素类合并放入50m1无菌水中稀释，将氨基酸全部放入50m1无菌水中稀释，将生长素放入10ml无菌水中稀释，接着将无机盐类各分别注入烧瓶中0.7升磁化水中，边加入边搅拌，再将蔗糖、固化剂、活性炭放入、进入高压灭菌30分钟，降温后取出，再将维生素溶液、氨基酸溶液、生长素溶液分别放入搅匀后，冷凝；

步骤5：生物反应器内放大培养

将烧瓶内悬浮培养20天的细胞群移入20升的生物反应器内放大培养，培养基用优选液态培养基培养10天后，再向内注入蔗糖10g和甲基茱莉酮酸酯5mg、无菌磁化水0.5升的混合液，再继续培养10天；

步骤6：细胞系培养物的提取分离

先将培养液用1um过滤器过滤，去掉培养液，将截留的粘胶状细胞系培养物取出，放入零下30度的冰箱内预冻3小时后，再放入液氮罐内超低温速冻2小时，取出解冻30分钟后，放入冰箱内预冻和液氮罐内速冻，依次2遍，然后将冷冻2次的细胞系黏液质取出，在室温下维持10分钟后，高速粉碎成60目冻粉，之后放入75％的3000m1乙醇液中间接加温26℃中低温下用旋转式真空蒸发器浓缩，同时收集乙醇，接着将浓缩物放进低温冷冻真空干燥机内，真空冷冻干燥，待含水分低于3％以下时取出，高速粉碎100目，装入铝泊袋内真空封口，即成为番茄植物干细胞乙醇提取物；

步骤7：复方番茄干细胞口服液的制备

先准备番茄干细胞粉1g，虫草多糖(含量为40％)3g，枸杞子多糖(含量为40％)6g，葛根黄酮(含量为40％)1g，超氧化物歧化酶(SOD)0.1g，蜂胶65ml，L-抗坏血酸0.05g，苯甲酸钠0.02g，磁化水30ml，备用，然后将除蜂胶外的物料全部放入30ml磁化水搅拌溶解后，再放入蜂胶搅匀，然后在放入40HZ的超声波清洗机内，进行超声粉碎混溶液中的细胞质20分钟，按常规法制成口服型药剂。