[发明专利]7α-羟基类固醇脱氢酶St-2-2的突变体T15G、T15S和T15A

说明书

本发明涉及羟基类固醇脱氢酶，具体涉及7α‑羟基类固醇脱氢酶St‑2‑2的突变体T15G、T15S和T15A。所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2，3或4所示，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的7α‑羟基类固醇脱氢酶的第15位氨基酸由Thr定点突变为Gly、Ser或Ala所得。所述突变体在相同底物TCDCA和NADP⁺的存在下，酶活分别是野生型的3.18、4.27、7.85倍，在生物转化TCDCA获取TUDCA的过程中具有巨大的应用潜力。

技术领域

本发明涉及羟基类固醇脱氢酶，具体涉及7α-羟基类固醇脱氢酶St-2-2的突变体T15G、T15S和T15A。

背景技术

羰基的不对称还原一直是化学反应研究的热点之一。虽然目前化学方法已经取得了一定的成果，但是化学方法往往存在催化剂种类和数目有限、立体选择性不高、辅助试剂昂贵且不易回收等缺点。而酶促反应不仅具有高效性、化学选择性、区域选择性，还具有高度的立体选择性。羟基类固醇脱氢酶(Hydroxysteroid dehydrogenase，HSDH)介导的酶促反应具有相对严格的立体选择性和“不”严格的底物特异性。例如，早在二十世纪八十年代初科学家就已经开始尝试利用微生物产生的7α-、7β-HSDH联合差向异构转化鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)合成熊去氧胆酸(Ursodesoxycholic acid，UDCA)。而游离酶还可以催化结合态胆汁酸——牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenodeoxycholic acid，TCDCA)转化为牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)。

HSDH的底物不仅仅局限在甾体类化合物，文献报道HSDH还可以催化烷基取代单环酮类、二环酮类等物质的羰基不对称还原。HSDH所具有的优秀催化品质决定了其在生物转化领域具有较大应用潜力。然而，活性更高的HSDH改造体是其在生物转化领域进一步应用的基本保障。近年来，科研人员逐渐认识到了7α-、7β-HSDH在生物转化领域所具有的巨大应用潜力。目前，GenBank中登记的功能已经确认的7α-HSDH共有8个，它们分别来自于Bacteroides fragilis、Clostridium scindens、Clostridium sordellii、Clostridiumabsonum、Stenotrophomonas maltophilia、Eubacterium sp.VPI 12708、Clostridiumdifficile和Escherichia coli；来自Clostridium absonum和Collinsella aerofaciens的7β-HSDH基因也已经成功被克隆。上述双酶偶联构建的生物转化体系不但克服了辅酶循环难题，还实现了氧化、还原“一锅式”进行特定化学区域的羟基差向异构。

酶的活性较低是限制其工业应用的主要因素之一，几乎所有的天然酶都需要经过改造后才能达到工业应用的要求。申请号为2019106381160，发明名称为“7α-羟基类固醇脱氢酶及其编码基因与应用”的中国专利申请中公布了一种7α-羟基类固醇脱氢酶St-2-2，该酶对TCDCA、GCDCA的催化活性优于本课题组前期发现的5个7α-HSDHs。目前，尚未见到关于该酶第15位氨基酸改造的相关报道。

发明内容

为进一步提高酶催化效率，本发明提供一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2，3或4所示，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的7α-羟基类固醇脱氢酶的第15位氨基酸由Thr变为Gly、Ser或Ala所得。

编码所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因也属于本发明的保护范围。

在本发明的优选实施例中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6，7或8所示。

包含所述基因的表达盒、载体或重组菌也属于本发明的保护范围。