[发明专利]一种定向合成右旋糖酐的融合酶及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种可以定向合成低分子量右旋糖酐的融合酶大肠杆菌工程菌的构建方法以及其应用，以P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因和链球菌来源的右旋糖酐酶基因为模板，以(EAAAK)_n(n＝0,1,2)为连接肽将两个酶基因按催化顺序进行同源重组并转化到BL21(DE3)大肠杆菌中，获得的可以定向合成不同低分子量右旋糖酐的融合酶大肠杆菌BL21(DE3)/dex‑YG‑nG‑a1dex(n＝0,1,2)基因工程菌。本发明构建的dex‑YG‑nG‑a1dex(n＝0,1,2)基因工程菌合成的右旋糖酐分子量集中，本发明构建的dex‑YG‑nG‑a1dex(n＝0,1,2)基因工程菌能通过控制条件与连接肽将大部分蔗糖直接转化为不同低分子量的右旋糖酐，其中可以直接获得右旋糖酐的重均分子量为1000‑2000Da，5000Da，10000Da。

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及一种定向合成低分子量右旋糖酐的融合酶构建方法及其应用。

背景技术

右旋糖酐及其衍生物已被广泛应用于食品系统中，如增稠剂、稳定剂、益生元以及改善小麦面包品质等。此外，右旋糖酐及其衍生物还应用于制药行业(作为载体、血容量扩大剂、抗血栓、抗凝血剂)，以及生物技术领域(分子筛)。由于人类α-淀粉酶只能缓慢地水解糖原的α(1,6)支键，并且可以快速地水解淀粉和糖原的α(1,4)支键。右旋糖酐引起的过敏反应(DIAR)似乎与化学结构有关。高分子量右旋糖酐和/或右旋糖酐中非α(1,6)键比与过敏反应的高发生率相关。因此，明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides 0326)生产的葡聚糖具有低的抗原性和高百分比(95％)的α(1,6)支链是很重要的。此外，与α(1,3)-键和β-键相比，α(1,3)-键具有较高的水溶性。为了获得临床级右旋糖酐，通常采用酸解或发酵高分子量右旋糖酐的方法。这些方法得到的右旋糖酐分子量分布广泛且不均匀，需要进行分馏才能得到纯产品。综上所述，这些方法对环境不友好、昂贵且耗时。酶的生产是绿色的，酶可以被修饰。一些复杂化学过程的结果是通过酶的定向修饰来实现的。例如，用截断的右旋糖酐蔗糖酶合成低聚右旋糖酐。利用右旋糖酐蔗糖酶的转糖基化功能，蔗糖作为供体，异麦芽糖或麦芽糖等糖受体参与催化获得寡糖。根据催化位点周围的残基特征和与产物的结合模式，通过定点诱变对酶活性中心进行微调，将产物分子量移动到低分子量。右旋糖酐蔗糖酶与右旋糖酐酶协同催化产生低分子量葡聚糖。然而，目前还未见一步法生产分子量更集中的右旋糖酐的报道。

右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase,EC 2.4.1.5)是一种由肠膜状明串珠菌(Leuconstoc mesenteriodes)和口腔链球菌(Oral Strepotococcus)产生的葡萄糖基转移酶，属于糖苷水解酶第70家族，该酶由1250到1600个不同的氨基酸构成，分子量约为170KDa，其在多糖类药物合成、药用辅料、保健食品和可降解生物材料的制备等多个领域均具有重要应用。该酶的催化是以蔗糖为底物，经酶切后释放出果糖，余下的D-葡萄糖基以α(1,6)键连接形式进行催化聚合，生成不同分子量的右旋糖酐。

右旋糖酐酶(Dextranase,α-1,6-D-glucan-6-glucanohydrolase；E.C.3.2.1.11)是一种能够专一性地降解右旋糖酐分子中α-1,6糖苷键的水解酶。通常根据对右旋糖酐的水解方式不同将该酶分为内切右旋糖酐酶(endodextranase EC 3.2.1.11，α-1,6-glucan-6-glucanohydrolase；也被称作右旋糖酐酶)和外切右旋糖酐酶(exodextranase EC3.2.1.70，glucan-1,6-α-glycosidase；也被称作右旋糖酐葡萄糖苷酶)。外切右旋糖酐酶主要从右旋糖酐链的非还原端降解α-(1,6)键，释放出葡萄糖。内切右旋糖酐酶随机水解右旋糖酐链内部的α-(1,6)键，生成系列中低分子量多糖。从已报道的研究结果来看，外切右旋糖酐酶主要是由肠道杆菌属所产生，而内切右旋糖酐酶的产生菌比较多，常见的有青霉菌、链球菌、芽孢杆菌和节杆菌。