[发明专利]基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法

权利要求书

1.基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，包括：

以E.coli O157:H7 为靶标，经过多轮筛选富集，获得特异性结合E.coli O157:H7的核酸适配体；

对所构建的A5适配体进行生物素修饰，通过链酶亲和素和生物素之间的结合反应，获得核酸适配体功能化的纳米富集磁珠，所述A5适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

对所构建的A4适配体进行量子点修饰，通过共价修饰制备得到核酸适配体功能化的量子点，所述A4适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

取核酸适配体功能化的纳米富集磁珠作为捕获探针，捕获反应体系中存在靶细菌，进行孵育后通过磁分离器回收磁珠适配体-靶细菌；然后向其中加入核酸适配体功能化的量子点，进行孵育结合；在磁场作用下富集磁珠，将沉淀重悬于缓冲液中使用荧光化学分析仪测定荧光强度，根据荧光强度确定食源性肠道致病菌O157：H7的菌落总数。

2.根据权利要求1所述的基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，所述核酸适配体功能化的纳米富集磁珠的制备方法为：

采用共沉淀法制备Fe₃O₄磁性纳米粒子；

将Fe₃O₄磁性纳米粒子分散于乙醇水溶液中，超声混合，加入氨丙基三乙氧基硅烷，机械搅拌并充入氮气保护，室温反应7～10 h，然后用磁铁进行磁分离，清洗、干燥后得到氨基功能化的Fe₃O₄磁性纳米粒子；

基于戊二醛法制备亲和素化氨基磁珠；

在A5核酸适配体的5’端进行生物素标记得到功能化的核酸适配体；

将亲和素化氨基磁珠和功能化的核酸适配体混合，得到核酸适配体功能化的纳米富集磁珠。

3.根据权利要求2所述的基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，所述共沉淀法制备Fe₃O₄磁性纳米粒子的步骤如下：将浓度为0.12 mol/L FeSO₄• 7H₂O和浓度为0.2 mol/L FeCl₃•6H₂O溶于去离子水溶液中，机械搅拌混合，并且通入氮气，充分去除溶液中的溶解氧后，逐滴加入浓度为2.5 mol/L的氢氧化钠溶液，使溶液pH达到11，在室温下1000 rpm剧烈搅拌30 min，水解产生的Fe₃O₄磁性纳米粒子以磁铁分离，分别用蒸馏水、去离子水、无水乙醇依次清洗各五次，60 ℃下真空干燥12h，得到Fe₃O₄磁性纳米粒子。

4.根据权利要求2所述的基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，所述戊二醛法制备亲和素化氨基磁珠的步骤如下：称取5mg氨基化磁珠溶解于5mL 10mM磷酸盐缓冲液中超声20min；向体系中加入1.25mL 25%戊二醛，室温缓慢振荡1h，在磁铁的作用下富集分离Fe₃O₄并用PBS清洗3次以去除物理性吸附的戊二醛；向Fe₃O₄磁性粒子加入500ul 1mg/mL的链霉亲和素，室温缓慢振荡6 h；在磁铁作用下富集分离亲和素化氨基磁铁，舍弃含有游离亲和素的上清，用PBS反复清洗；向亲和素化氨基磁珠中加入5 mL 10 mg/mL 的 BSA室温缓慢振荡 6 h 以封闭未反应的和非特异性结合位点，在磁铁作用下富集分离磁性粒子并反复清洗，最终重悬于 5 mL 10 mM 的PBS 中，置于 4℃保存备用。