[发明专利]一种通过易错PCR技术及高通量筛选提高葡萄糖基转移酶EUGT11酶活方法

说明书

本发明提供一种易错PCR技术及高通量筛选提高葡萄糖基转移酶EUGT11酶活的方法，包括以下步骤：a.EUGT11易错PCR扩增;b.易错PCR突变体库构建;c.高通量筛选酶活提高突变菌株；d.高酶活突变菌株序列分析。实现对大肠杆菌表达的葡萄糖基转移酶EUGT11基因进行定向进化，筛选得到提高葡萄糖基转移酶EUGT11酶活及可溶表达量的关键碱基突变位点。

技术领域

本发明本发明提供一种易错PCR技术及高通量筛选提高葡萄糖基转移酶EUGT11酶活的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

甜菊糖甙（俗称甜菊糖、甜菊糖苷）是一种从菊科草本植物甜叶菊（或称甜菊叶）中精提的新型天然甜味剂，而南美洲使用甜叶菊作为药草和代糖已经有几百年历史。甜菊糖甙是天然低热量甜味剂。甜菊糖的热值仅为蔗糖的1/300,摄入人体后不被吸收,不产生热量,是糖尿病和肥胖病患者适用的甜味剂。甜菊糖与蔗糖果糖或异构化糖混用时,可提高其甜度,改善口味。可用于糖果、糕点、饮料、固体饮料、油炸小食品、调味料、蜜饯。国际甜味剂行业的资料显示，甜菊糖甙已在亚洲、北美、南美洲和欧盟各国广泛应用于食品、饮料、调味料的生产中。

甜菊糖苷类化合物组分众多，均具有四环二萜母核并且有不同程度的糖基化修饰，从而有不同程度的甜味口感。目前甜菊糖苷类化合物中甜菊苷（Stevioside,ST）、莱鲍迪苷A（RA）在甜叶菊中含量相对丰富，都具有高甜度，但口感上存在后苦味，相比之下莱鲍迪苷D（RD）具有更好的口感特征。甜叶菊中RD含量低，仅占干叶重0.5%左右，从甜叶菊中分离提纯产量低生产成本高，无法满足市场需求。葡萄糖基转移酶EUGT11在UDPG存在条件下能够催化RA生成RD。已构建的原始EUGT11大肠杆菌表达菌株酶活较低，EUGT11酶可溶表达量低。

易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。其关键在于对合适突变频率的选择，突变频率太高会导致绝大多数突变为有害突变，无法筛选到有益突变;突变频率太低则会导致文库中全是野生型群体。理想的碱基置换率和易错的最佳条件主要依赖于突变的DNA片段的长度。

通常，经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错PCR(sequentialerror-pronePCR)策略。即将一次扩增得到的有益突变基因作为下一次扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次扩增得到的正向突变累积而产生重要的有益突变。

发明内容

本发明的目的是为了提高大肠菌株表达葡萄糖基转移酶EUGT11酶活，实现RA到RD的高效转化，提供一种通过易错PCR技术及高通量筛选提高葡萄糖基转移酶EUGT11酶活方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种通过易错PCR技术及高通量筛选提高葡萄糖基转移酶EUGT11酶活方法，其特征在于包括如下步骤：

a.EUGT11易错PCR扩增;以实验室构建好的PET30a-EUGT1质粒为模板，用引物EP-BsaI-FGAGGTCTCTACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGC和EP-BsaI-RATGGTCTCGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCA进行易错PCR扩增，PCR扩增产物经质量分数为1.2%的琼脂糖凝胶电泳后，切胶纯化回收目的条带。

b.易错PCR突变体库构建;纯化后的产物与载体PET30a进行Goldengate连接，连接产物转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态，涂布于固体LB平板(50μg/mLKana)抗性筛选阳性转化子，所有转化子构成易错PCR突变体库。