[发明专利]一种高活性重组蛋白的制备方法

说明书

本发明涉及重组蛋白纯化技术领域，特别涉及一种高活性重组蛋白的制备方法。该制备方法包括如下步骤：将重组蛋白的HPLC纯化样品与蛋白溶解液混合，进行溶解处理；将溶解处理后的样品与复性液混合，进行复性处理；采用阴离子交换层析柱对复性处理后样品进行纯化，得到高活性重组蛋白。本发明通过对蛋白溶解液和复性液的配方进行了改进，进一步解决了通过HPLC纯化的重组蛋白丧失生物活性的问题，制备出高活性、高纯度的重组蛋白样品，同时操作简单，无内毒素和有机溶剂残留，适合视网膜新生血管治疗使用。

技术领域

本发明涉及重组蛋白纯化技术领域，特别涉及一种高活性重组蛋白的制备方法。

背景技术

湿性老年性黄斑变性(AMD)和糖尿病视网膜病变(DR)缺乏理想的治疗措施。临床上主要采用对症治疗或辅助性治疗方法来控制或延缓疾病的发展，常用的治疗方法如下：降糖药物、抗炎药物、局部使用TNF-α拮抗剂、菲诺贝特、血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂、RAS系统抑制剂、非酶糖基化抑制剂、综合疗法和激光治疗。抗-VEGF治疗近期效果较好，但涉及到定期眼内注射抗-VEGF单抗(如Lucentis)，不仅具有一定的伤害性，而且价格昂贵且只针对确诊病例，此外，尽管发生率很低，但每次注射均会带来眼内感染、视网膜出血和剥离的严重风险，而且这种治疗方法反复用药后会产生耐药性。

2013年全球糖尿病视网膜病变(DR)患者9300万，其中增殖性DR(PDR)患者1700万，糖尿病性黄斑水肿患者2100万，威胁视力的DR患者2800万。糖尿病发病5年后糖尿病视网膜病变发生率为25％，10年后增至60％，15年后可高达75％-80％。如此可见，加快研制新型治疗眼底血管病变制剂，不仅具有社会效益，而且将会产生巨大的经济效益。

2006年重组人IL-18(商品名：Iboktadekin)作为抗肿瘤制剂进入临床试验阶段，由GlaxoSmithKline公司研发。已有多篇文章报道了IL-18人体试验是安全的，而且未见有关眼部副作用的报道。此外，已经报道给啮齿类全身注射IL-18，在视网膜可检出较高含量的IL-18，这一结果提示IL-18在视网膜中的生物可用性。病人使用IL-18可能引起1-2级的短暂发热，但能快速缓解。用高达2000μg/kg剂量，病人的眼部也没出现明显副作用。综上所述重组IL-18在眼科学中的研究结果表明IL-18对眼部病理性新生血管性疾病可能具有应用价值。既然目前已证明IL-18临床试验试是安全的，那么IL-18就可用于CNV和湿性AMD的辅助治疗研究，它能否成为有效的药物，值得进一步深入研究。

新近研究发现眼内注射IL-18可以有效治疗人工诱导小鼠视网膜新生血管病变(CNV)发生和发展；而且IL-18基因敲除小鼠会出现严重的视网膜新生血管病变；此外研究证明鼠源性和人源性的重组IL-18对视网膜色素上皮细胞(RPE)都是非常安全的。有报道房水中IL-18含量高的患者在接受Lucentis单抗治疗黄斑水肿及视网膜静脉栓塞时将显著改善视觉效果，同时证明VEGF以相互抑制的方式调控IL-18含量，并用多个视网膜/CNV模型证明重组IL-18能够调节病理模型的眼底渗出，因此IL-18可能成为调控视网膜病理性新生血管生成的新方法。1995年IL-18作为IFNγ诱导因子被报道，随后证明给小鼠全身注射IL-18(50μg/kg)6天，对FGF诱导的角膜毛细血管生成具有抑制作用。也有报道表明IL-18对氧诱导的小鼠视网膜病变模型的视网膜病理性新生血管的生成具有调控作用。因此IL-18在理论有可能成为治疗视网膜新生血管病变的候选药物。