[发明专利]基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法及应用

权利要求书

1.一种基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法，其特征在于，包括以下步骤：

A．将鼠源单克隆抗体的Fab段与人源化的IgG1的Fc段进行基因重组，此过程中对人源化的IgG1的Fc段进行突变，在Fc段末端引入半胱氨酸；

其中，人源化的IgG1-Fc的核苷酸突变序列如SEQ ID No：1所示，氨基酸突变序列如SEQID No：2所示；

B. 然后通过双功能交联剂，将抗体Fc段定向偶联至氨基微球上，具体包括：

a. 取氨基聚苯乙烯微球，用PB，pH 7.2缓冲液稀释至3 mg/ml；

b．称取2 mg 双功能交联剂，用DMSO溶至3 mg/ml；将稀释好的SMCC溶液按照1:4的体积比例投入步骤a制备的微球稀释液中，37℃恒温震荡孵育0.5小时，完成后离心去除上清，并用PB，pH 7.2缓冲液重悬；所述双功能交联剂为4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐、琥珀酰亚胺基-[4-(N-马来酰亚胺甲基)]-环己烷-1-甲酸-(6-氨基己酸酯)、氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯、3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯的任一种；

c. 用PB，pH 7.2缓冲液将基因工程改造的巯基化抗体稀释至1 mg/ml，按照1:5的体积比加入到步骤b制得的SMCC活化好的微球中；37℃恒温震荡孵育1小时，并在完成后加入1％牛血清白蛋白溶液封闭，37℃恒温震荡孵育1小时；

d. 取上述封闭后试剂离心去除上清，并用10 mM Tris，4% 海藻糖，pH7.5溶液重悬混匀；再用超声分散，即得定向偶联的抗体微球复合物。

2.根据权利要求1所述的基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法，其特征在于：所述步骤A中，所述鼠源单克隆抗体是通过噬菌体展示技术建立抗体库，并筛选出的亲和力高的抗体。

3.根据权利要求2所述的基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法，其特征在于：所述步骤A的具体实验过程为，从免疫动物中获取B细胞——提取总RNA——逆转录获取cDNA-PCR获取目的基因——克隆至噬菌粒载体——电转至大肠杆菌——辅助噬菌体超染——收集上清获取文库——筛选文库找到目的噬菌粒——获取抗体基因——重组抗体——融合IgG1-Fc突变序列——在真核细胞中表达抗体。

4.根据权利要求1所述的基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法，其特征在于：所述步骤A中，突变位点包括：48位P突变成C，168位Y突变成C，179位G突变成C，185位S突变成C，194位W突变成C，210位H突变成C，221位S突变成C。

5.权利要求1-4任一所述基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法制备的抗体微球复合物。

6.权利要求1-4任一所述基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法在制备血清淀粉样蛋白A检测试剂、D-二聚体检测试剂或降钙素原检测试剂中的应用或在免疫比浊方法中的应用。