[发明专利]RNA解旋酶突变体、突变基因及其在制备维生素B2

说明书

本发明公开了一种RNA解旋酶突变体、突变基因及其在制备维生素B2中的应用。其中所述突变体的多肽氨基酸序列相对于SEQ ID No.3所示序列仅存在下述突变：第236位亮氨酸突变为精氨酸。本发明以RNA解旋酶cshB为基础，选择第236位的氨基酸进行定点突变，将枯草芽孢杆菌BS‑1中RNA解旋酶编码基因cshB变为RNA解旋酶突变体(L236R)与枯草芽孢杆菌BS‑1相比，含有RNA解旋酶突变体(L236R)的菌株可以提高产维生素B₂的能力达11.5％，因而在制备维生素B₂中具有很大的应用价值。

技术领域

本发明涉及RNA解旋酶突变体、突变基因及其在制备维生素B₂中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

核黄素(Riboflavin)又称维生素B₂，分子式为C₁₇H₂₀O₆N₄，是维生素B族中的一种水溶性维生素，在生物体内以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)两种形式存在，作为机体内一些重要的氧化还原酶的辅酶参与氧化还原反应，起到递氢的作用。核黄素的缺乏会导致生物体代谢发生障碍，但人和动物均不能自身合成，只能从食物中摄取，因此核黄素的生产在食品、饲料以及医药行业都具有非常广阔的市场。

目前核黄素的工业生产方法有植物萃取法、化学合成法、半合成法以及微生物合成法。其中，微生物合成法以其成本低、环境友好以及能源可再生等优点逐步占据主导地位，成为大部分工业化生产的主要方法。在众多可生产核黄素的微生物中，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)作为一种非病原微生物，生理代谢及遗传背景清楚，便于确定代谢靶点及基因工程改造，并具有可靠的安全性，它们的发酵产物在食品与饲料业中已有长期的应用，对环境、医药和工业发酵生产都非常重要。其次枯草芽孢杆菌基因工程菌株能够过量合成叶酸、肌苷或鸟苷，具有为核黄素过量合成提供足够前体物的潜力，因此枯草芽孢杆菌基因工程菌在核黄素的微生物发酵生产中逐渐显示出了强大的生命力，成为主要生产菌株。

枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中核黄素的合成需要5-磷酸核酮糖(Ru5P)和鸟嘌呤-5’-三磷酸(GTP)两个前体物质，其中Ru5P来源于磷酸戊糖途径，GTP来源于嘌呤的从头合成途径。二者在一些列核黄素操纵子的作用下经7步反应由核黄素合成途径最终合成核黄素。

DEAD-盒式RNA解旋酶负责在翻译过程中将mRNA的二级结构破坏，并促进核糖体RNA的成熟。(González-Gutiérrez JA,Díaz-Jiménez DF,Vargas-Pérez I,Guillén-SolísG,Stülke J,Olmedo-lvarez G.The DEAD-Box RNA Helicases of Bacillus subtilisas a Model to Evaluate Genetic Compensation Among Duplicate Genes.FrontMicrobiol.2018Sep 25；9:2261.doi:10.3389/fmicb.2018.02261.PMID:30337909；PMCID:PMC6178137.)枯草芽孢杆菌中DEAD-盒式RNA解旋酶由四个基因cshA,cshB,deaD/yxiN编码，其中cshB除了负责70s核糖体成熟外，还控制mRNA的降解(Andreou,A.Z.,andKlostermeier,D.(2013).The DEAD-box helicase eIF4A.RNA Biol.10,19–32.doi:10.4161/rna.21966)。核黄素合成的过程中需要消耗GTP，而RNA的合成过程中也许要GTP，蛋白质合成中则需要GTP提供高能磷酸键。这些反应都与核黄素合成竞争前体GTP。因而认为RNA解旋酶会影响核黄素的生成，即RNA解旋酶编码基因的表达水平与核黄素的生成存在一定的潜在联系。目前，尚未有RNA解旋酶突变基因用于维生素B₂合成的报道。

发明内容