[发明专利]一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR引物探针组和试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR引物探针组，包括引物组和探针组，其特征在于，所述引物组包括：用于检测米根霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；用于检测微小根毛霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；用于检测伞枝横梗霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示。

2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述探针组包括：用于检测米根霉的探针，序列如SEQ ID NO.7所示；用于检测微小根毛霉的探针，序列分别如SEQ ID NO.8所示；用于检测伞枝横梗霉的探针，序列如SEQ ID NO.9所示。

3.如权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述引物组还包括：用于检测内参基因GAPDH的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；所述探针组还包括：用于检测内参基因GAPDH的探针，序列如SEQ ID NO.12所示。

4.一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2或3所述的引物探针组。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括：PCR反应缓冲液、氯化镁、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶和尿嘧啶-N-糖基化酶。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，用于检测米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的3种探针分别带有3种不同的荧光标记。

7.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，还包括：阴性对照品、阳性对照品和内参照；所述阴性对照品为无核酸酶污染的去离子水；所述阳性对照品为含有米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉DNA片段的质粒，所述DNA片段包含三种菌对应引物的扩增片段；所述内参照为人组织DNA样本。

8.一种如权利要求4~7之一所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对待测样品进行DNA提取，获得核酸样本；

（2）将引物探针组、PCR反应缓冲液、氯化镁、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶和尿嘧啶-N-糖基化酶配制成PCR反应液，将核酸样本加入PCR反应液中，获得PCR反应体系；

（3）对PCR反应体系进行多重qPCR扩增。

9.如权利要求8所述的使用方法，其特征在于，步骤（2）中，所述PCR反应液中，用于检测米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的上游引物和下游引物的浓度均为0.3~0.4μmol/L，用于检测米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的探针的浓度分别为0.9~1.2μmol/L、0.3~0.4μmol/L和0.6~0.8μmol/L。

10.如权利要求8所述的使用方法，其特征在于，步骤（3）中，所述多重qPCR扩增的反应程序如下：50~55℃预热5~6min；90~95℃预变性8~10min；90~95℃变性15~20s，60~65℃退火和延伸55~60s，40~45个循环。