[发明专利]一种CHO细胞表达的重组新型冠状病毒NCP-RBD蛋白的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种CHO细胞表达的重组新型冠状病毒NCP-RBD蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)细胞复苏培养：取工作细胞株进行复苏培养，得到细胞复苏培养物；

(2)细胞扩增培养：将细胞复苏培养物进行扩增，得到细胞扩增培养物；

(3)罐培养：将细胞扩增培养物进行罐培养，得到细胞收获液；

(4)纯化：对细胞收获液进行纯化，得到所需产物；

其中，工作细胞株为表达重组新型冠状病毒NCP-RBD蛋白的重组CHO细胞株；

所述的罐培养的具体过程如下：

将检定合格的细胞扩增培养物，转接至新鲜的无血清培养基中，进行罐培养，初始密度不低于3.0×10⁵个/ml，置于生长温度36.5±1℃，溶氧不低于45％，pH值不低于6.5条件下进行罐培养；

当培养3～4天时，开始补加补料培养基，补加体积为初始体积的10±1％，每次补料间隔1～2天；当培养4～5天时，开始补糖，使培养期间葡萄糖浓度不低于1g/L；

罐培养时间达到7～13天且细胞活率为90±10％时，进行收获，得到细胞收获液，作为生产收获物；

其中，所述的无血清培养基为EX-CELL-Advanced CHO基础培养基；

所述的补料培养基为EX-CELL Advanced CHO Feed 1补料培养基；

检定合格的细胞扩增培养物为细胞密度不小于1.0×10⁶个/ml且细胞活率不低于90％的细胞扩增培养物；

所述的纯化包括如下步骤：

澄清过滤：对细胞收获液进行离心、过滤，得到NCP-RBD澄清液；

超滤浓缩：对澄清过滤得到的NCP-RBD澄清液进行浓缩和超滤，得到浓缩液；

离子交换层析：对浓缩液进行离子交换层析处理，得到纯化液；

灭活：对纯化液进行灭活，得到灭活液；

过滤病毒和细菌：对灭活液进行过滤除去病毒和细菌，得到所需产物；

所述的离子交换层析包括以下步骤：

阴离子交换层析：将浓缩液经过阴离子交换层析柱，使其与阴离子交换填料相互作用后以流穿模式收集流穿液，即为第一步柱纯化液；

阳离子交换层析：将第一步柱纯化液再次经过阳离子交换层析柱，使其与阳离子交换填料相互作用后洗脱，收集目的蛋白洗脱液，即为第二步柱纯化液；

所述的阴离子交换层析中阴离子交换填料为带有-CH2N+(CH3)3季铵基功能基团的阴离子交换填料；

所述的阴离子交换层析具体包括以下步骤：

用10～30mM PB缓冲液平衡层析柱至基线平稳；

将浓缩液经过阴离子交换层析柱，使其与阴离子交换填料相互作用，并收集流穿液，即为第一步柱纯化液；

所述的阳离子交换层析中阳离子交换填料为带有-CH₂CH₂CHSO₃黄丙基功能基团的阳离子交换填料；

所述的阳离子交换层析具体包括以下步骤：

用10～30mM PB缓冲液平衡层析柱至基线平稳；

将第一步柱纯化液经过阳离子交换层析柱，使其与阳离子交换填料相互作用；

上样结束后，用10～30mM PB缓冲液平衡缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳；

使用含NaCl的10～30mM PB缓冲液洗脱，收集目的蛋白洗脱液，即为第二步柱纯化液，其中，NaCl的浓度不低于0.1M。

2.根据权利要求1所述的CHO细胞表达的重组新型冠状病毒NCP-RBD蛋白的制备方法，其特征在于，所述的细胞复苏培养的具体过程如下：取工作细胞株接种至新鲜的无血清培养基中，初始密度不低于3.0×10⁵个/ml，置于37±1℃，5±1％CO₂，100～150rpm条件下悬浮培养2～4天，得到细胞复苏培养物；其中，所述的无血清培养基为EX-CELL CD CHO Fusion培养基。