[发明专利]一种N-糖基化修饰提高黑曲霉木聚糖酶热稳定性的方法

说明书

本发明公开了一种N‑糖基化修饰提高黑曲霉木聚糖酶热稳定性的方法，属于基因工程技术领域。通过酶学性质测定，突变体酶T59N的半衰期tsubgt;1/2/subgt;supgt;50℃/supgt;提高至340min，突变体酶A55N/D57S/T59N在50℃下孵育500min，酶活没有下降趋势，孵育1260min，酶活只损失25.6％。突变体酶A55N/D57S/T59N的比酶活为290.5U/mg，较xynA提高了70.4％，且在pH2.0‑9.0间很稳定，孵育1h仍能保持70％以上的酶活力，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种N-糖基化修饰提高黑曲霉木聚糖酶热稳定性的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

于食品、医药、饲料和新能源等方面。虽然木聚糖酶研究时间较长且来源广泛，但是面对不同应用条件，常因为酶解效率低，耐受性不足等问题而限制了其使用。木聚糖酶主要分布于第5、8、10、11、30和43家族。目前研究最多的木聚糖酶来源于第10和第11家族，其中，11家族的木聚糖酶表现出较广泛的pH耐受性和底物特异性，但是其热稳定性较差是亟需解决的问题。

前期研究中，王灵等比较了毕赤酵母和大肠杆菌中表达的xynA，前者的热稳定性和比酶活均高于后者，确定了N-糖基化对xynA的影响。方程等人将木聚糖酶xynHB的214位糖基化位点氨基酸N突变为A，突变体在毕赤酵母表达的重组酶在60℃半衰期由12min提高到65min。N-糖基化是真核生物中比较常见的蛋白质修饰现象，其可以通过糖链的作用影响蛋白质的结构或者起到保护的作用，从而提升蛋白质的催化效率和耐受性，但是正确位置的糖基化才能达到理想的效果，不是所有的糖基化位点的突变都能使木聚糖酶热稳定性提高，本发明旨在寻找合适的糖基化位点以期获得热稳定性提高的木聚糖酶。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定性提高的木聚糖酶突变体。

[技术方案]

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种热稳定性提高的木聚糖酶突变体，所述木聚糖酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了编码上述木聚糖酶突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的载体。

在一种实施方式中，所述载体以pMD19为表达载体。

本发明还提供了表达上述基因或上述载体的宿主细胞。

在一种实施方式中，所述宿主细胞包括真菌、细菌和古细菌。

在一种实施方式中，所述宿主细胞包括黑曲霉。

本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌表达上述的木聚糖酶突变体。

在一种实施方式中，所述重组菌以pMD19为表达载体。

在一种实施方式中，所述重组菌以黑曲霉为宿主细胞。

本发明还提供了一种提高木聚糖酶热稳定性的方法，所述方法为将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的木聚糖酶的第53位的甘氨酸突变为苏氨酸，第55位的丙氨酸突变为天冬酰胺，第57位的天冬氨酸突变为丝氨酸，第59位的苏氨酸突变为天冬酰胺，第61位的丝氨酸突变为天冬酰胺和/或第65位的苏氨酸突变为天冬酰胺。

在一种实施方式中，所述方法为将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的木聚糖酶的第55位的丙氨酸突变为天冬酰胺，第57位的天冬氨酸突变为丝氨酸和/或第59位的苏氨酸突变为天冬酰胺。

本发明还提供了一种用于降解木聚糖的组合物，所述组合物含有上述木聚糖酶突变体作为活性成分，以所述组合物的总重量为基准，所述木聚糖酶的含量为10-90重量％。