[发明专利]一种通过迭代饱和突变提高木聚糖酶热稳定性的方法

说明书

本发明公开了一种通过迭代饱和突变提高木聚糖酶热稳定性的方法，属于基因工程领域领域。本发明通过经过5轮筛选得到突变体A124P/A130N/T121V/T129L/I126V，最佳反应温度为60℃，较xynA上升10℃。野生型酶xynA的半衰期tsubgt;1/2/subgt;supgt;50℃/supgt;为18min，突变体在50℃下孵育1200min，酶活没有下降趋势。在55℃、60℃和下70℃孵育5min，仍然能保持76.8％、68.4％和35.5％的酶活力，且在pH 2.0‑9.0间很稳定，孵育1h仍能保持70％以上的酶活力，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种通过迭代饱和突变提高木聚糖酶热稳定性的方法，属于基因工程领域领域。

背景技术

木聚糖酶酶系包括β-1,4-D-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、β-D-1,4木糖苷酶(EC3.2.1.37)、α-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.55)和α-L-葡萄糖醛酸苷酶(EC 3.2.1.139)，其中，β-1,4-D-木聚糖酶是最关键的酶，它以内切的方式将β-1,4-糖苷键断裂。该酶在食品、医药、饲料和新能源等方面应用广泛，但由于其热稳定性较差，在生产过程中限制了其使用。其中，11家族木聚糖酶由于其pH耐受性和底物特异性具有较大潜力，但热稳定性差是亟需解决的问题。

随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展，已有许多学者运用这项技术成功对蛋白的热稳定性进行了改造。如专利CN104911163B中，发明人构建了5个突变体，最适温度提高了2-17℃，65-80℃范围内的半衰期提高了2-16倍。李治宏将11家族木聚糖酶loop区的T152突变为Phe，在70℃条件下活性比野生型提高27％。但目前的并没有热稳定性提高的同时保持pH稳定性的木聚糖酶。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定性提高且保持pH稳定性的木聚糖酶。

[技术方案]

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种木聚糖酶突变体，所述木聚糖酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了编码上述木聚糖酶突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的载体。

在一种实施方式中，所述载体以pET-22b(+)为表达载体。

本发明还提供了表达上述基因或上述载体的宿主细胞。

本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌表达上述木聚糖酶突变体。

在一种实施方式中，所述重组菌以pET-22b(+)为表达载体。

在一种实施方式中，所述重组菌以大肠杆菌为宿主细胞。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括E.coli JM109和E.coli BL21。

本发明还提供了一种提高木聚糖酶热稳定性的方法，所述方法为将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的木聚糖酶的第121位的苏氨酸突变为缬氨酸，第124位的丙氨酸突变为脯氨酸，第126位的异亮氨酸突变为缬氨酸，第129位的苏氨酸突变为亮氨酸和/或第130位的丙氨酸突变为天冬酰胺。

本发明还提供了一种用于降解木聚糖的组合物，所述组合物含有上述木聚糖酶突变体作为活性成分，以所述组合物的总重量为基准，所述木聚糖酶的含量为10-90重量％。

本发明还提供了上述木聚糖酶突变体，或上述基因，或上述载体，或上述重组菌，或上述组合物在降解木聚糖中的应用。

[有益效果]