[发明专利]可调控启动子

权利要求书

1.通过培养包含表达构建体的重组甲基营养型酵母来产生感兴趣蛋白质的方法，所述表达构建体包含可调控的启动子和在所述启动子的转录调控下的编码感兴趣蛋白质的核酸分子，所述方法包括以下步骤：

a)用阻遏所述启动子的基础碳源培养所述细胞系，其中所述基础碳源是葡萄糖、甘油或其混合物，

b)用使所述启动子去阻遏且完全诱导的无葡萄糖或有有限量葡萄糖的条件，培养所述细胞系，并

c)产生并回收所述感兴趣蛋白质，

其中所述启动子包含选自下组的核酸序列：

i)由SEQ ID 1的核苷酸序列组成的pG1、由SEQ ID 2的核苷酸序列组成的pG3、由SEQID 4的核苷酸序列组成的pG4、由SEQ ID 3的核苷酸序列组成的pG6、由SEQ ID 5的核苷酸序列组成的pG7、或由SEQ ID 6的核苷酸序列组成的pG8；和

ii)由SEQ ID 41的核苷酸序列组成的pG1a、由SEQ ID 42的核苷酸序列组成的pG1b、由SEQ ID 43的核苷酸序列组成的pG1c、由SEQ ID 44的核苷酸序列组成的pG1d、由SEQ ID 45的核苷酸序列组成的pG1e和由SEQ ID 46的核苷酸序列组成的pG1f。

2.权利要求1的方法，其中所述启动子是功能活性的启动子，其为碳源可调控的启动子，所述启动子在重组真核细胞中，在完全诱导的状态下、并且是用化学性质确定的且无甲醇的给料培养基时，能以相比于所述细胞的天然pGAP启动子至少20％的转录速率表达感兴趣蛋白质。

3.依照权利要求1的方法，其中所述步骤b)采用不提供葡萄糖或提供有限量的葡萄糖的补料培养基。

4.依照权利要求1至2中任一项的方法，其中所述有限量为所述培养基中0-1g/L。

5.依照权利要求1的方法，其中所述葡萄糖为生长限制性的，以保持特定生长速率(specific growth rate)在0.02h^-1至0.2h^-1的范围内。

6.依照权利要求1的方法，其中所述葡萄糖为生长限制性的，以保持特定生长速率在0.02h^-1至0.15h^-1的范围内。

7.权利要求1的方法，其中所述启动子是由SEQ ID 1的核苷酸序列组成的pG1或其功能活性变体。

8.依照权利要求1的方法，其中所述启动子选自下组：由SEQ ID 1的核苷酸序列组成的pG1、由SEQ ID 41的核苷酸序列组成的pG1a、由SEQ ID 42的核苷酸序列组成的pG1b、由SEQID 43的核苷酸序列组成的pG1c、由SEQ ID 44的核苷酸序列组成的pG1d、由SEQ ID 45的核苷酸序列组成的pG1e和由SEQ ID 46的核苷酸序列组成的pG1f。

9.依照权利要求1的方法，其中所述感兴趣蛋白质为异源蛋白质。

10.依照权利要求9的方法，其中所述异源蛋白质选自治疗性蛋白质，包括抗体或其片段、酶和肽、蛋白质抗生素、毒素融合蛋白、碳水化合物-蛋白质偶联物、结构蛋白、调节蛋白、疫苗和疫苗样蛋白或颗粒、生长因子、激素和细胞因子。